本文關(guān)鍵詞： 馬藍(lán) 轉(zhuǎn)錄組 吲哚生物堿 內(nèi)參篩選 基因功能　出處：《華僑大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：藥效物質(zhì)是中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ),是中藥品質(zhì)的物質(zhì)內(nèi)涵。馬藍(lán)Baphicacanthus cusia,由其莖葉炮制而成的青黛,以福建產(chǎn)品質(zhì)最佳,被譽(yù)為建青黛,是福建道地藥材之一。馬藍(lán)的根入藥稱(chēng)南板藍(lán)根,為清熱解毒類(lèi)的代表中藥。馬藍(lán)市場(chǎng)需求量大,種植只顧數(shù)量不顧質(zhì)量導(dǎo)致種質(zhì)資源保護(hù)缺失。道地藥材是保證中藥具有確切臨床療效的關(guān)鍵,道地藥材種質(zhì)資源保護(hù)刻不容緩�！敖M學(xué)”時(shí)代的來(lái)臨為我們從分子水平認(rèn)識(shí)生物提供了前所未有的機(jī)遇,在技術(shù)上為研究藥用植物種質(zhì)資源帶來(lái)了飛躍性的進(jìn)步。二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展成熟提供了一個(gè)快速、高通量、全面解讀藥用植物基因水平信息的全新技術(shù)手段,為遺傳信息背景零星的物種獲取批量基因序列提供了有效途徑。以靛藍(lán)、靛玉紅為代表的吲哚生物堿類(lèi)成分是馬藍(lán)發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ),挖掘馬藍(lán)中吲哚生物堿類(lèi)成分合成途徑基因并揭示其功能將為馬藍(lán)道地種質(zhì)資源保護(hù)提供有力支撐。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)成功獲得馬藍(lán)無(wú)菌苗,并在此基礎(chǔ)上建立了馬藍(lán)快繁培養(yǎng)技術(shù)快速獲得大量馬藍(lán)組培苗,為探索馬藍(lán)再生植株體系和毛狀根體系提供豐富的外植體資源;與此同時(shí),通過(guò)對(duì)叢生芽誘導(dǎo),再生苗的增殖、生根、壯苗、煉苗條件的摸索建立了菘藍(lán)再生植株體系,為后續(xù)進(jìn)行馬藍(lán)基因體內(nèi)功能研究提供補(bǔ)充路徑。2.利用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)完成馬藍(lán)器官轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及注釋,建立了包含293666條unigenes的馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),在基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基礎(chǔ)上,通過(guò)途徑注釋,獲得了編碼馬藍(lán)吲哚類(lèi)途徑16個(gè)催化酶的44條編碼基因,本研究首次建立了馬藍(lán)基因數(shù)據(jù)庫(kù),為獲取馬藍(lán)目的基因序列打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.對(duì)馬藍(lán)的內(nèi)參基因進(jìn)行系統(tǒng)篩選并對(duì)其最適內(nèi)參進(jìn)行驗(yàn)證,最終確定在所候選的內(nèi)參基因中,18S rRNA為馬藍(lán)應(yīng)激條件下葉片中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,UBC為非應(yīng)激條件下馬藍(lán)不同器官基因表達(dá)的最適內(nèi)參,本研究確定了馬藍(lán)中第一個(gè)適合的內(nèi)參基因,為后續(xù)進(jìn)行馬藍(lán)基因表達(dá)研究提供了基礎(chǔ)條件。4.從馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得BcSK序列和BcDXR序列,通過(guò)RT-PCR克隆技術(shù)獲得其ORF序列;SMART分析顯示BcSK具有一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,BcDXR具有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,進(jìn)化樹(shù)分析和聚類(lèi)分析均顯示二者與芝麻、煙草具有較高的同源性,通過(guò)構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體并對(duì)其定位分析顯示二者均定位于葉綠體中;構(gòu)建BcSK原核表達(dá)載體并進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化,采用雙酶偶聯(lián)紫外分光光度法測(cè)定蛋白活力為4.26u/g;利用類(lèi)胡蘿卜素累積實(shí)驗(yàn)證明BcDXR能使大腸桿菌pAC-BETAipi中類(lèi)胡蘿卜素積累增加;通過(guò)農(nóng)桿菌浸染法獲得BcSK過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)再生植株與毛狀根,RT-qPCR分析顯示轉(zhuǎn)入BcSK的再生植株中目的基因表達(dá)增加29.6倍,毛狀根中目的基因表達(dá)增加38.1倍,指標(biāo)化合物的LC-MS含量測(cè)定結(jié)果說(shuō)明了基因表達(dá)的增加促進(jìn)了莽草酸途徑的合成代謝;同法獲得BcDXR過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)毛狀根,目的基因表達(dá)增加14倍,LC-MS含測(cè)結(jié)果亦證實(shí)了BcDXR能夠在萜類(lèi)途徑中發(fā)揮作用。綜上,本研究從馬藍(lán)組培、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、內(nèi)參篩選到基因功能首次展開(kāi)了馬藍(lán)藥效物質(zhì)形成關(guān)鍵基因的挖掘與功能研究工作,可為揭示馬藍(lán)藥效物質(zhì)合成途徑及馬藍(lán)道地種質(zhì)保護(hù)提供參考。
[Abstract]:In this paper , we have established a new technique for improving the quality of Chinese medicinal plants , which is a new technique for the research on the quality of the plant . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research contents and results are as follows : 1 . The research on the gene of the plant tissue culture has provided a new technique for the research of the gene level of the Ma Lan . The results showed that BcDXR could increase the accumulation of carotenoids in E . coli pAC - BETAipi by means of double - enzyme coupled ultraviolet spectrophotometry . The results showed that the expression of BcDXR increased by 29 . 6 times . The results of RT - qPCR showed that BcDXR could play a role in the synthesis of shikimic acid .

【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S567.239

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