本文關(guān)鍵詞： 水稻 葉片發(fā)育 厚壁組織細胞 雄性育性 基因克隆　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：水稻是世界上重要的糧食作物之一,且水稻籽粒產(chǎn)量與葉片和穎花的發(fā)育密切相關(guān)。近年來,雖然許多葉片與穎花發(fā)育相關(guān)基因已成功分離并應(yīng)用在水稻育種中,用以提高水稻產(chǎn)量。然而,其復(fù)雜的遺傳調(diào)控機制仍不清楚。因此,進一步鑒定影響葉片與穎花發(fā)育的新基因,不僅能為水稻發(fā)育調(diào)控機制提供新的見解,還能為水稻株型與產(chǎn)量分子育種奠定基礎(chǔ)。本研究采用圖位克隆策略分離了水稻葉片、花藥與籽粒發(fā)育相關(guān)的基因NRL2,并初步分析了其分子功能。主要結(jié)果如下：我們通過篩選水稻EMS突變體庫,獲得了2個葉片極度窄且半卷曲、雄性半不育、籽粒更加細長的等位突變體,命名為(narrow and rolled leaf 2-1) nrl2-1和nrl2-2。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,nrl2突變體縱向葉脈數(shù)減少、遠軸端厚壁組織細胞分化異常、絨氈層退化和小孢子發(fā)育異常。利用nrl2-1突變體與粳稻品種中花17雜交構(gòu)建的F2分離群體,將NRL2基因精細定位于第3號染色體標(biāo)記M4與M5之間,其物理距離約為59 kb。比較野生型與nrl2突變體精細定位區(qū)間DNA序列,我們發(fā)現(xiàn)LOC_Os03g19520在nrl2-1突變體的第9個外顯子(+2662位置)存在一個單堿基G缺失,導(dǎo)致讀碼移框和編碼蛋白的提前終止：而在nrl2-2突變體的第15個內(nèi)含子3'剪接接收部位堿基G突變?yōu)閴A基A,導(dǎo)致]mRNA剪切模式改變和蛋白編碼提前終止。進一步的遺傳轉(zhuǎn)化證據(jù)表明LOC_Os03g19520即目的基因NRL2。酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗表明,NRL2和RL14存在蛋白互作。測量劍葉次生細胞壁主要成分發(fā)現(xiàn),與野生型相比,nrl2突變體葉片中的纖維素含量明顯提高而木質(zhì)素含量顯著降低,與rl14突變體的變化一致。分析苯丙氨酸代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),肉桂醇、楊梅素和二氫山奈酚的含量在nrl2突變體和nrl2/rl14雙突中的含量顯著降低。另外,苯丙氨酸代謝相關(guān)基因的表達水平在nrl2突變體與野生型之間也發(fā)生了改變,表明NRL2基因的突變影響了苯丙氨酸代謝途徑,改變了木質(zhì)素和黃酮醇的含量,進一步導(dǎo)致半卷曲的葉片和降低的雄性育性。另外,通過mRNA原位雜交和qRT-PCR分析我們發(fā)現(xiàn),NRL2基因的突變影響了一些細胞分裂相關(guān)基因的表達。我們同時也發(fā)現(xiàn),nrl2突變體穎殼的外厚壁組織細胞數(shù)比野生型要少,表明NRL2基因可能通過調(diào)控細胞增殖而調(diào)節(jié)葉片和籽粒的大小。而觀察穎殼外厚壁組織細胞發(fā)現(xiàn),突變體nrl2細胞數(shù)量較野生型顯著減少,結(jié)果表明NRL2基因可能通過調(diào)控細胞增殖來調(diào)節(jié)葉片和籽粒大小。綜上所述,NRL2基因是一個重要的發(fā)育調(diào)節(jié)因子控制基本的發(fā)育過程,是一個潛在的高產(chǎn)水稻育種目標(biāo)。
[Abstract]:Rice is one of the most important food crops in the world, and the grain yield is closely related to the development of leaves and spikelets. Although many genes related to leaf and spikelet development have been successfully isolated and applied in rice breeding to increase rice yield, its complex genetic regulation mechanism is still unclear. Further identification of new genes affecting the development of leaves and spikelets can not only provide new insights into the regulatory mechanism of rice development. It can also lay the foundation for rice plant type and yield molecular breeding. In this study, the gene NRL2 related to rice leaf, anther and grain development was isolated by map cloning strategy. The main results are as follows: we obtained two allelic mutants with extremely narrow and semi-curly leaves, semi-sterile male and more slender grain by screening rice EMS mutants. They were named narrow and rolled leaf 2-1) nrl2-1 and nrl2-2.The results of histological analysis showed that they were compared with wild type. The number of longitudinal leaf veins of nrl2 mutant decreased, and the differentiation of thick-walled cells in the distal end of the mutant was abnormal. Nrl2-1 mutant and japonica rice variety Zhonghua 17 were used to construct F2 segregated population. The NRL2 gene was mapped finely between M4 and M5 on chromosome 3, and the physical distance was about 59 kb.Compared with the fine mapping region DNA sequence of wild type and nrl2 mutants. We found that LOC_Os03g19520 had a single base G deletion in the ninth exon (2662) of the nrl2-1 mutant. This led to the early termination of the reading frame and the coding protein: base G mutated to base A at the 3'splicing reception site of the 15th intron of the nrl2-2 mutant. The further evidence of genetic transformation showed that LOC_Os03g19520 was the target gene NRL2.yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence. Complementary experiments show that. There was protein interaction between NRL2 and RL14. The main components of secondary cell wall of flag leaf were measured. It was found that compared with wild type, the content of cellulose in leaves of nrl2 mutant increased significantly, and the content of lignin decreased significantly. Analysis of phenylalanine metabolites showed that cinnamyl alcohol was found. The contents of myricetin and dihydrokaempferol in nrl2 mutant and nrl2/rl14 diploid were significantly decreased. The expression level of phenylalanine metabolism-related genes was also changed between nrl2 mutant and wild type, indicating that the mutation of NRL2 gene affected phenylalanine metabolism pathway. The content of lignin and flavonol was changed, which further led to semi-curly leaves and reduced male fertility. In addition, we found by mRNA in situ hybridization and qRT-PCR analysis. The mutation of NRL2 gene affected the expression of some genes related to cell division. We also found that the number of outer thick-walled cells in glume of nrl2 mutant was less than that of wild type. The results suggested that NRL2 gene may regulate the size of leaves and grains by regulating cell proliferation, while the number of nrl2 cells in the mutant was significantly lower than that in the wild type by observing the thick-walled cells outside the glume. The results showed that NRL2 gene may regulate leaf and grain size by regulating cell proliferation. In conclusion, NRL2 gene is an important developmental regulatory factor to control the basic development process. It is a potential breeding goal for high yield rice.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S511

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本文編號：1452458