本文關(guān)鍵詞：稻瘟菌效應(yīng)因子AvrPiz-t及其水稻靶蛋白APIP12的功能研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 稻瘟菌 水稻 AvrPiz-t APIP12 抗病機制 蛋白互作

【摘要】：植物在與病原微生物的自然競爭過程中,進化出兩個層次的免疫系統(tǒng)來識別和防御病原物。第一層是由植物跨膜受體類蛋白識別病原物模式分子觸發(fā)的免疫(PTI)。第二層是由植物抗病蛋白(R)識別病原菌的效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫(ETI)。本課題組在水稻Piz-t基因克隆的基礎(chǔ)上,圖位克隆了其對應(yīng)的稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t,并利用酵母雙雜交技術(shù)從水稻cDNA文庫篩選到12個AvrPiz-t互作蛋白(APIPs),同時借助于核磁共振技術(shù)與合作實驗室解析了AvrPiz-t的三維溶液結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,本文開展了對稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t和水稻互作蛋白APIP12的研究,主要結(jié)果如下：1.利用已有的蛋白溶液結(jié)構(gòu)信息,對AvrPiz-t預(yù)測的功能相關(guān)的氨基酸和表面分布的堿性氨基酸通過構(gòu)建不同表達(dá)載體進行了突變,分別進行了功能互補,蛋白互作和亞細(xì)胞定位的研究。在／AvrPiz-t突變體轉(zhuǎn)化稻瘟菌接種水稻的功能互補研究中,參與蛋白去泛素化的催化中心的H25A和N64A兩個關(guān)鍵氨基酸突變都失去了無毒功能,而相鄰的Q22A的突變不影響其無毒功能,表明催化中心的氨基酸對AvrPiz-t的功能非常重要。與12個APIP蛋白的酵母雙雜互作研究中,C23A、H25A、A41V口C70A四個催化中心相關(guān)的氨基酸殘基突變體與APIP2、APIP6和APIP10泛素化功能相關(guān)的互作都明顯變?nèi)趸蛲耆?進一步證明了AvrPiz-t的去泛素化活性中心氨基酸與泛素化蛋白的緊密聯(lián)系。同時,在互補分析中未失去無毒功能的Q22A和D89A突變與12個APIP蛋白的互作也無明顯變化,表明AvrPiz-t的功能與APIP蛋白的互作存在著正相關(guān)性。在亞細(xì)胞定位的研究中,AvrPiz-t在細(xì)胞中的位置與葉綠體重合,而氨基酸的突變基本不影響其亞細(xì)胞定位的變化。2.APIP12是AvrPiz-t在水稻中的互作蛋白,在N端和C端各有一個結(jié)構(gòu)域與核孔蛋白Nup98同源,但不包含F(xiàn)G重復(fù)結(jié)構(gòu)域,剩余序列在其它物種中找不到同源序列,因此APIP12可能是水稻的特有基因。我們通過酵母雙雜和GSTPull-down驗證了AvrPiz-t與APIP12的相互作用。水稻接種稻瘟菌后APIP12的表達(dá)都明顯上調(diào),表明APIPl2參與了水稻稻瘟病的抗病反應(yīng)。水稻中花11的APIP12基因敲除突變體和日本晴APIP12 RNAi轉(zhuǎn)基因系對稻瘟病的感病性增加,而且PR1O等基因在敲除系中的表達(dá)下降。在Piz-t水稻中敲除或過表達(dá)APIP12不會影響其對含AvrPiz-t稻瘟菌的抗病性,而且APIP12與Piz-t的LRR,NT和NBS結(jié)構(gòu)域在酵母雙雜實驗中沒有檢測到互作,表明APIP12在Piz-t介導(dǎo)的抗病信號傳導(dǎo)途徑中并不重要。APIP12的位于細(xì)胞質(zhì)中的未知結(jié)構(gòu)內(nèi),但AvrPiz-t與APIP12共轉(zhuǎn)化煙草時,AvrPiz-t能夠與APIP12共定位,表明APIP12可能會與AvrPiz-t結(jié)合而改變其位置。APIP12與其它APIP蛋白中的APIP6和APIP8都能發(fā)生相互作用,因此這些APIP蛋白不是獨立存在的,APIP之間也存在相互作用。綜上所述,AvrPiz-t的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測的催化中心氨基酸突變后,都失去了無毒功能,其與水稻泛素化功能相關(guān)的蛋白互作也變?nèi)趸蛳?證明了AvrPiz-t的功能可能與去泛素化相關(guān)。APIP12參與了水稻的基礎(chǔ)抗性,但不參與Piz-t介導(dǎo)的對AvrPiz-t的抗病。
[Abstract]:In this paper , we studied the effect of AvrPiz - t on the function of AvrPiz - t .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.111.41

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