本文關(guān)鍵詞：荷斯坦奶牛免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn)結(jié)構(gòu)及其多樣性形成機(jī)制的研究　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)是適應(yīng)性免疫最重要的效應(yīng)分子之一,其中跨膜型IgM又是B淋巴細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵受體分子。在人和小鼠中,IgM編碼基因的突變會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞的缺失,從而引起嚴(yán)重的免疫缺陷。以前的研究發(fā)現(xiàn)牛免疫球蛋白重鏈基因有著非常獨(dú)特的特點(diǎn)——基因組中存在著兩個(gè)有功能的免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn),分別位于21號(hào)和11號(hào)染色體上,它們各有一個(gè)編碼IgM的μ基因。免疫球蛋白基因表達(dá)過(guò)程中存在等位排斥現(xiàn)象,即一條染色體上免疫球蛋白基因的成功表達(dá)會(huì)使對(duì)應(yīng)的同源染色體上的基因片段的重組關(guān)閉,因此牛兩個(gè)位點(diǎn)上的μ基因如何協(xié)調(diào)表達(dá)以保證B細(xì)胞的正常發(fā)育和每個(gè)B細(xì)胞的單一抗原特異性是一個(gè)令人困擾的問(wèn)題。此外,與人和小鼠相比,牛免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段數(shù)目非常有限,它如何利用很少的可變區(qū)基因片段產(chǎn)生足夠多的抗體多樣性是另外一個(gè)值得探討的重要問(wèn)題。本研究通過(guò)尼龍膜原位雜交方法對(duì)荷斯坦奶牛RP42-BAC文庫(kù)進(jìn)行了全面的篩選并獲得了30個(gè)包含牛重鏈基因的BAC克隆。利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)實(shí)驗(yàn)確定�；蚪M中只存在一個(gè)免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn)并位于21號(hào)染色體上,而在11號(hào)染色體上不存在有功能的重鏈基因位點(diǎn)。基于對(duì)7個(gè)BAC克隆的全長(zhǎng)測(cè)序和長(zhǎng)片段PCR實(shí)驗(yàn),我們獲得了包括部分V區(qū)在內(nèi)的免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息,所測(cè)得的基因組片段按如下順序排列：5'-VHn-DHn-JHn-μ1-(ψδ-ψV-DHn)3-JHn-μ2-δ-γ3-γ1-γ2-δ-α-3'。本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)有功能的μ基因線性排列在同一重鏈基因位點(diǎn)上,因此并不存在等位排斥問(wèn)題。這兩個(gè)μ基因除了可以通過(guò)VDJ重組獨(dú)立表達(dá)外,μ2基因也可以通過(guò)CSR機(jī)制(class swit ch recombination, CSR)進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)分析顯示荷斯坦奶牛在整個(gè)發(fā)育階段的幾乎各個(gè)器官組織中都主要表達(dá)IgM2(μ2)亞型。分析IgM1和IgM2的重鏈可變區(qū)序列發(fā)現(xiàn)二者在陽(yáng)性/陰性選擇以及物理化學(xué)性質(zhì)上并無(wú)顯著差異。在長(zhǎng)約284 Kb的部分V區(qū)序列中僅發(fā)現(xiàn)了12個(gè)有功能的VH基因片段,它們屬于同一家族而且具有很高的同源性(89%)。在四個(gè)DH位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)23個(gè)DH片段,16個(gè)具有重組功能,其中有一個(gè)超長(zhǎng)的DH片段,其編碼長(zhǎng)度達(dá)到149 bp。VDJ重組分析證明IgMl和IgM2對(duì)于DH,JH片段的使用都有著極強(qiáng)的偏好性,這導(dǎo)致VH-DH-JH的組合多樣性更加有限。通過(guò)與人和小鼠可變區(qū)CDR3H cDNA序列的比較,發(fā)現(xiàn)牛CDR3H的長(zhǎng)度變化范圍非常廣(3-60+aa),而N,P核苷酸加入情況與小鼠類(lèi)似,推測(cè)牛免疫球蛋白顯著的連接多樣性的產(chǎn)生更依賴(lài)由外切酶的剪切作用導(dǎo)致的CDR3H長(zhǎng)度和序列變化的多態(tài)性。cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)有功能的超長(zhǎng)CDR3H只存在于IgM2亞型,且全部由DH8片段參與編碼,但分析基因組中VDJ重組產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)通過(guò)超長(zhǎng)N,P核苷酸的加入,部分其他DH片段也可以參與超長(zhǎng)CDR3H的產(chǎn)生。另外由于參與編碼牛IgM2 CDR3H的DH片段長(zhǎng)度普遍較長(zhǎng),IgM2CDR3H的平均長(zhǎng)度也明顯長(zhǎng)于人,小鼠以及牛IgM1。牛主要依賴(lài)半胱氨酸形成的二硫鍵穩(wěn)定CDR3H的空間結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生空間多樣性,這在超長(zhǎng)CDR3H中體現(xiàn)得更加明顯。綜上所述,我們證明�；蚪M中只有一個(gè)免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn),并獲得了較為完整的結(jié)構(gòu)信息。雖然牛的兩個(gè)μ基因都具有功能,但在各個(gè)組織和不同發(fā)育時(shí)期主要表達(dá)μ2基因。牛主要通過(guò)增加連接多樣性程度和CDR3H平均長(zhǎng)度來(lái)彌補(bǔ)因?yàn)榭勺儏^(qū)基因片段數(shù)目有限造成的VDJ重組多樣性的不足。此外,牛超長(zhǎng)CDR3H主要是通過(guò)DH8基因片段參與重組產(chǎn)生,理論上也可以通過(guò)超長(zhǎng)N,P核苷酸的插入形成。本研究為理解牛免疫球蛋白重鏈基因的多樣性產(chǎn)生機(jī)制以及牛兩個(gè)μ基因的協(xié)同表達(dá)的問(wèn)題提供了明確的線索和證據(jù)。
[Abstract]:In this study , we found that there are two functional immunoglobulin heavy chain gene loci on chromosome 21 and chromosome 11 . In conclusion , we prove that there is only one immunoglobulin heavy chain gene locus in the bovine genome , and the more complete structural information is obtained . Although the two 渭 genes of the cattle have the function , we can compensate for the deficiency of VDJ recombination diversity due to the limited number of genes in the variable region . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823
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本文編號(hào)：1412362