本文關(guān)鍵詞：荷斯坦奶牛免疫球蛋白重鏈基因位點結(jié)構(gòu)及其多樣性形成機(jī)制的研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)是適應(yīng)性免疫最重要的效應(yīng)分子之一,其中跨膜型IgM又是B淋巴細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵受體分子。在人和小鼠中,IgM編碼基因的突變會導(dǎo)致B細(xì)胞的缺失,從而引起嚴(yán)重的免疫缺陷。以前的研究發(fā)現(xiàn)牛免疫球蛋白重鏈基因有著非常獨特的特點——基因組中存在著兩個有功能的免疫球蛋白重鏈基因位點,分別位于21號和11號染色體上,它們各有一個編碼IgM的μ基因。免疫球蛋白基因表達(dá)過程中存在等位排斥現(xiàn)象,即一條染色體上免疫球蛋白基因的成功表達(dá)會使對應(yīng)的同源染色體上的基因片段的重組關(guān)閉,因此牛兩個位點上的μ基因如何協(xié)調(diào)表達(dá)以保證B細(xì)胞的正常發(fā)育和每個B細(xì)胞的單一抗原特異性是一個令人困擾的問題。此外,與人和小鼠相比,牛免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段數(shù)目非常有限,它如何利用很少的可變區(qū)基因片段產(chǎn)生足夠多的抗體多樣性是另外一個值得探討的重要問題。本研究通過尼龍膜原位雜交方法對荷斯坦奶牛RP42-BAC文庫進(jìn)行了全面的篩選并獲得了30個包含牛重鏈基因的BAC克隆。利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)實驗確定�；蚪M中只存在一個免疫球蛋白重鏈基因位點并位于21號染色體上,而在11號染色體上不存在有功能的重鏈基因位點�；趯�7個BAC克隆的全長測序和長片段PCR實驗,我們獲得了包括部分V區(qū)在內(nèi)的免疫球蛋白重鏈基因位點結(jié)構(gòu)信息,所測得的基因組片段按如下順序排列：5'-VHn-DHn-JHn-μ1-(ψδ-ψV-DHn)3-JHn-μ2-δ-γ3-γ1-γ2-δ-α-3'。本研究發(fā)現(xiàn)兩個有功能的μ基因線性排列在同一重鏈基因位點上,因此并不存在等位排斥問題。這兩個μ基因除了可以通過VDJ重組獨立表達(dá)外,μ2基因也可以通過CSR機(jī)制(class swit ch recombination, CSR)進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)分析顯示荷斯坦奶牛在整個發(fā)育階段的幾乎各個器官組織中都主要表達(dá)IgM2(μ2)亞型。分析IgM1和IgM2的重鏈可變區(qū)序列發(fā)現(xiàn)二者在陽性/陰性選擇以及物理化學(xué)性質(zhì)上并無顯著差異。在長約284 Kb的部分V區(qū)序列中僅發(fā)現(xiàn)了12個有功能的VH基因片段,它們屬于同一家族而且具有很高的同源性(89%)。在四個DH位點中共發(fā)現(xiàn)23個DH片段,16個具有重組功能,其中有一個超長的DH片段,其編碼長度達(dá)到149 bp。VDJ重組分析證明IgMl和IgM2對于DH,JH片段的使用都有著極強(qiáng)的偏好性,這導(dǎo)致VH-DH-JH的組合多樣性更加有限。通過與人和小鼠可變區(qū)CDR3H cDNA序列的比較,發(fā)現(xiàn)牛CDR3H的長度變化范圍非常廣(3-60+aa),而N,P核苷酸加入情況與小鼠類似,推測牛免疫球蛋白顯著的連接多樣性的產(chǎn)生更依賴由外切酶的剪切作用導(dǎo)致的CDR3H長度和序列變化的多態(tài)性。cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)有功能的超長CDR3H只存在于IgM2亞型,且全部由DH8片段參與編碼,但分析基因組中VDJ重組產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)通過超長N,P核苷酸的加入,部分其他DH片段也可以參與超長CDR3H的產(chǎn)生。另外由于參與編碼牛IgM2 CDR3H的DH片段長度普遍較長,IgM2CDR3H的平均長度也明顯長于人,小鼠以及牛IgM1。牛主要依賴半胱氨酸形成的二硫鍵穩(wěn)定CDR3H的空間結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生空間多樣性,這在超長CDR3H中體現(xiàn)得更加明顯。綜上所述,我們證明牛基因組中只有一個免疫球蛋白重鏈基因位點,并獲得了較為完整的結(jié)構(gòu)信息。雖然牛的兩個μ基因都具有功能,但在各個組織和不同發(fā)育時期主要表達(dá)μ2基因。牛主要通過增加連接多樣性程度和CDR3H平均長度來彌補(bǔ)因為可變區(qū)基因片段數(shù)目有限造成的VDJ重組多樣性的不足。此外,牛超長CDR3H主要是通過DH8基因片段參與重組產(chǎn)生,理論上也可以通過超長N,P核苷酸的插入形成。本研究為理解牛免疫球蛋白重鏈基因的多樣性產(chǎn)生機(jī)制以及牛兩個μ基因的協(xié)同表達(dá)的問題提供了明確的線索和證據(jù)。
[Abstract]:In this study , we found that there are two functional immunoglobulin heavy chain gene loci on chromosome 21 and chromosome 11 . In conclusion , we prove that there is only one immunoglobulin heavy chain gene locus in the bovine genome , and the more complete structural information is obtained . Although the two 渭 genes of the cattle have the function , we can compensate for the deficiency of VDJ recombination diversity due to the limited number of genes in the variable region . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
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本文編號：1412363