本文關(guān)鍵詞：復(fù)幼提高核桃不定根發(fā)生能力的多基因作用機(jī)制　出處：《北京林業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 核桃 復(fù)幼 不定根 多基因 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

【摘要】：核桃(Juglans L.)為難生根木本植物。通過連續(xù)嫁接、埋干黃化等措施,成功地實(shí)現(xiàn)了成齡品種的復(fù)幼,并得到大于98%的生根率。這項(xiàng)技術(shù)解決了核桃扦插無性繁殖的難題,推動(dòng)了良種整株無性系化進(jìn)程,也為深入探討樹木器官的發(fā)生機(jī)制提供了理論依據(jù)和研究平臺(tái)。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上,采用RNA-seq技術(shù)和生物信息學(xué)分析的方法,著眼于多基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),探索復(fù)幼提高核桃不定根發(fā)生能力及調(diào)控不定根發(fā)生、發(fā)育過程中的分子機(jī)制,獲得如下結(jié)果：1.建立了高頻、同步的核桃復(fù)幼嫩枝扦插不定根發(fā)生體系。(1)插穗的制備：成齡品種通過連續(xù)10次以上嫁接,結(jié)合埋干黃化技術(shù),可獲得同步性高、生根率穩(wěn)定和生根速度快的復(fù)幼嫩枝插穗,扦插后9d生根率達(dá)98%以上；(2)插穗的最佳表型特征：半木質(zhì)化、長(zhǎng)度14 cm～18 cm、4～6節(jié)位、復(fù)葉與嫩莖夾角45～60°；(3)插穗的扦插前處理：實(shí)驗(yàn)表明生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA+NAA (4:1)組合5 mg·L-1速蘸插穗基部,較單一IB A 5 mg·L-1速蘸插穗基部更高效更經(jīng)濟(jì)。2.確立了以插穗表型特征和組織學(xué)觀察為標(biāo)準(zhǔn)的精準(zhǔn)取樣方法：①誘導(dǎo)期：插后1 d-2d,插穗基部無明顯表型變化。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)形成層細(xì)胞開始活動(dòng)、核仁變大、細(xì)胞質(zhì)變濃、染色加深；②形成層細(xì)胞旺盛分裂期：插后3d-5d,插穗基部增粗,表面出現(xiàn)不規(guī)則點(diǎn)狀突起。組織學(xué)觀察可見到形成層細(xì)胞進(jìn)入旺盛分裂,細(xì)胞層數(shù)明顯增多；③根原基形成期：插后6d-8d,插穗基部繼續(xù)增粗,表面出現(xiàn)縱向裂縫并隨扦插時(shí)間的延長(zhǎng)而加寬；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),特定位置的束間形成層細(xì)胞繼續(xù)分裂,并開始不對(duì)稱的平周和垂周分裂,逐漸形成輪廓近圓形的根原基；④根原基伸長(zhǎng)期：扦插9d后,插穗基部的裂口處可見到類似不定根的乳白色突起。根原基外側(cè)細(xì)胞分裂速度加快,細(xì)胞群體積持續(xù)增大、伸長(zhǎng),并逐漸分化出維管組織。3.利用RNA-seq技術(shù)獲得不定根發(fā)生、發(fā)育過程中的基因時(shí)序表達(dá)數(shù)據(jù),得到如下結(jié)果：(1)原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控過濾,收獲了290.0 G高質(zhì)的clean reads。經(jīng)de novo組裝,共得到58920條unigenes,對(duì)應(yīng)99 375條轉(zhuǎn)錄本(N50=1485)；(2)依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù),參照Nr蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選出的前21位植物物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組注釋信息,經(jīng)Blast比對(duì),其中14670條Unigenes獲得功能注釋。4.復(fù)幼提高核桃不定根發(fā)生能力的差異網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果如下：(1)基于模型的表達(dá)模式聚類及組內(nèi)差異分析,篩選出復(fù)幼前后嫩枝插穗在不定根誘導(dǎo)發(fā)生過程中的差異表達(dá)基因962條。經(jīng)GO功能富集分析和KEGG代謝通路分析,這些差異基因主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生物節(jié)律及α-亞麻酸和亞油酸代謝等生物學(xué)過程；(2)復(fù)幼處理前后ARF、MYB、MYB、NAC、WRKY以及WOX等一些轉(zhuǎn)錄因子家族成員及其靶基因間調(diào)控關(guān)系在不定根發(fā)生過程中發(fā)生顯著變化,推測(cè)這些變化就是復(fù)幼提高不定根能發(fā)生能力的重要原因；5.復(fù)幼嫩枝插穗不定根發(fā)生過程中內(nèi)參基因的篩選及測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證。采用qRT-PCR技術(shù),對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因在不定根發(fā)生過程中5個(gè)時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行分析,并通過geNorm軟件確定了最佳內(nèi)參基因?yàn)镚APDH和ACT2;選擇10條Unigenes,以GAPDH為內(nèi)參基因,對(duì)RNA-seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示RNA-seq計(jì)算的表達(dá)量結(jié)果與qRT-PCR分析結(jié)果高度吻合,從而證明RNA-seq測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。6.建立了木本植物RNA-seq數(shù)據(jù)中l(wèi)ncRNA鑒定及功能預(yù)測(cè)分析流程。以公共數(shù)據(jù)庫(NCBI)中桑樹(Morus notabilis)的RNA-seq數(shù)據(jù)為例。共鑒定出1133條新的lncRNAs,其中106條分別在根、樹皮、葉片、雄花和芽中特異表達(dá)。結(jié)合特異表達(dá)和基因組定位信息進(jìn)行功能預(yù)測(cè),結(jié)果顯示部分lncRNAs可能在桑樹根和花器官的發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。該方法對(duì)于木本植物RNA-seq數(shù)據(jù)中l(wèi)ncRNAs的挖掘和功能研究具有重要的借鑒意義。
[Abstract]:Walnut (Juglans L.) difficult to root woody plants. Through continuous grafting, buried dry yellowing and other measures, successfully realized the old varieties of complex young, and the rooting rate is greater than 98%. This technology can solve the problem of cutting the asexual reproduction of walnut varieties, promote the whole clone process also provides the theoretical basis and research platform for further study the mechanism of trees organs. This study on the basis of previous work, using the method of RNA-seq technology and bioinformatics analysis, focusing on the gene transcription regulatory network, explore the complex young adventitious root formation ability and improve the regulation of adventitious root formation of walnut, the molecular mechanism in the development process the results are as follows: 1. the establishment of the frequency synchronization of complex walnut cuttings adventitious root system tender. (1) cuttings preparation: mature varieties by more than 10 consecutive stem grafting, combined with embedded technology can be yellow. 寰楀悓姝ユ，

本文編號(hào)：1382450