本文關(guān)鍵詞：棉花耐鹽基因篩選及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的紡織纖維作物和油料作物。目前,鹽脅迫構(gòu)成了影響棉花生長、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的主要危害。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展,植物抗鹽基因工程研究已取得了一定成績,但由于生物抗鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀,其生理、生化過程是基因相互作用、共同調(diào)節(jié)的結(jié)果,因此發(fā)掘棉花鹽相關(guān)基因,探究棉花耐鹽途徑仍是研究棉花抗鹽性的重要目標(biāo)。本研究建立了棉花在水培條件下病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induce gene silencing,VIGS)體系,篩選出棉花多種鹽相關(guān)基因；成功克隆出棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1基因,揭示了GhPTP1基因在棉花鹽響應(yīng)途徑中起負(fù)調(diào)控作用,并在酵母雙雜交文庫中篩選GhPTP1作用蛋白。研究結(jié)果如下：成功建立了水培條件下棉花VIGS基因沉默體系。在24℃C條件下,出苗后5天內(nèi)進(jìn)行注射能得到較高沉默效率,重懸液濃度對沉默效率沒有影響,同時(shí)以注射pTRV-GFP做空白對照可以消除插入片段對植株生長的影響,減小對照誤差；水培與土培方式相比能更快更早出現(xiàn)沉默表型,縮短實(shí)驗(yàn)周期,并能誘導(dǎo)水培條件下不同品種棉花材料GhCLA1基因沉默；利用水培棉花TRV-VIGS體系,成功抑制了棉花GhCTRl基因的表達(dá),與對照株相比,抑制后的棉花植株出現(xiàn)矮化表型。通過篩選VIGS-cDNA文庫,沉默棉花未知基因,獲得一系列耐鹽及鹽敏感表型,測序結(jié)果顯示候選基因主要編碼與光合作用相關(guān)的蛋白、編碼磷酸酶、ACR家族蛋白和功能未知蛋白等。本研究根據(jù)前期測序結(jié)果,克隆了棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTPl基因,該基因全長849bp,編碼283個(gè)氨基酸,具有家族特征性序列(V/I)HCXXGXXR(S/T)。序列同源比對分析顯示GhPTPl與梅花、橙子、葡萄、可可、煙草蛋白有較高同源性。GhPTP1與擬南芥AtDSP8和AtDSP10屬于同一分支。組織特異性表達(dá)及亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,GhPTPl基因在棉花根、葉中表達(dá)較高,并定位于細(xì)胞膜。qRT-PCR結(jié)果顯示,GhPTPl基因表達(dá)量在棉花不同組織部位均受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)。在ABA及PEG誘導(dǎo)處理下,該基因表達(dá)上調(diào),H2O2則誘導(dǎo)基因下調(diào),提示GhPTP1可能參與植物逆境脅迫下的信號(hào)通路。GhPTP1基因沉默植株在鹽濃脅迫下表現(xiàn)出明顯抗鹽表型,干物重顯著高于對照,且VIGS-GhP TP1植株中的GhNHX1、GhSOS和GhSOS2的基因表達(dá)量高于對照；在擬南芥中,GhPTP1過表達(dá)提高了植株對鹽的敏感性,子葉變綠率和根長均低于對照,植株Na+積累量則高于對照植株,結(jié)果表明GhPTPl在棉花鹽響應(yīng)信號(hào)途徑中起負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)GhPTP1基因沉默降低了植株對滲透脅迫的敏感性,其葉片相對含水量與對照相比顯著增加,失水率低于對照,轉(zhuǎn)GhPTPl基因擬南芥表現(xiàn)出了明顯的干旱脅迫表型。結(jié)果表明GhPTPl能夠參與NaCl引起的滲透脅迫及Na+脅迫途徑,并通過參與SOS途徑影響植株Na+含量。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到30多個(gè)GhPTP1的互作蛋白,這些蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)合蛋白、離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白等。免疫共沉淀及煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)驗(yàn)證了GhPTP1與GhANN5的互作關(guān)系,且鹽脅迫可誘導(dǎo)GhPTP1與GhANN5的互作。
[Abstract]:Cotton (Gossypium hirsutum L.) is a textile fiber crop and oil crop in the world. At present, the impact of salt stress of cotton growth, yield and fiber quality of the main hazards. With the rapid development of modern molecular biology, studies on the salt tolerance of plant genetic engineering has made some achievements, but due to the biological salt resistance quantitative trait controlled by multiple genes, their physiological and biochemical process of gene interactions, CO regulation results, so to explore cotton genes related to salt tolerance of cotton cotton, an important goal of inquiry way is still the salt of the salt tolerance. This study established a virus induced gene silencing cotton in Hydroponic conditions (Virus induce gene silencing, VIGS) system, selected a variety of cotton salt related gene; clone cotton protein tyrosine phosphatase GhPTP1 gene revealed that GhPTP1 gene in cotton salt response pathway The negative regulation, and screening of GhPTP1 interacting protein in yeast two hybrid library. The results were as follows: successfully established cotton VIGS gene silencing system under hydroponic conditions. At 24 DEG C under the condition of 5 days after emergence of injection can achieve high silencing efficiency re suspension concentration has no effect on the silencing efficiency at the same time. In the case of pTRV-GFP as blank insert can eliminate the impact on the growth of seedlings, reduce the control error; water culture and soil culture than faster earlier silent phenotype, shorten the experimental period, and different varieties of cotton GhCLA1 gene silencing induced by hydroponics culture; hydroponic cotton TRV-VIGS system successfully inhibited the expression of GhCTRl gene in cotton, compared with the control plants, cotton plants after inhibition of dwarf phenotype. By screening the VIGS-cDNA library, silent cotton unknown gene, obtained a series of salt and The salt sensitive phenotype, the sequencing result showed that the main candidate gene encoding and photosynthesis related protein, encoding phosphatase, ACR family proteins and unknown function protein. This study based on the results of the preliminary sequencing of cloned cotton protein tyrosine phosphatase GhPTPl gene, the gene of full length 849bp encoding 283 amino acids, with family characteristic sequence (V/I) HCXXGXXR (S/T). Sequence homology analysis showed that GhPTPl and plum, orange, grape, cocoa, tobacco protein has high homology with Arabidopsis.GhPTP1 AtDSP8 and AtDSP10 belong to the same branch. Tissue specific expression and subcellular localization showed that GhPTPl gene in cotton root, higher expression in leaves, and located on the cell membrane.QRT-PCR the results showed that GhPTPl gene expression was induced by salt stress increased in different tissues of cotton. In ABA and PEG induced treatment, expression of the gene H2O2 is induced Gene expression, suggesting that GhPTP1 may be involved in the signaling pathway of.GhPTP1 gene silencing plants under abiotic stress in plant salt stress concentration showed obvious salt resistant phenotype, dry weight was significantly higher than that of control, VIGS-GhP and TP1 in the plants of GhNHX1, GhSOS and GhSOS2 gene expression was higher than that of the control; in Arabidopsis, overexpression of GhPTP1 increased the sensitivity of plants to salt, cotyledon greening rate and root length were lower than the control plants, the accumulation of Na+ is higher than that of the control plants, the results show that the GhPTPl response plays a negative regulatory role of signaling pathways in the cotton salt. At the same time GhPTP1 gene silencing reduced the sensitivity of plants to osmotic stress, the relative water content of leaves significantly compared with control increase the rate of water loss was lower than that of control, GhPTPl transgenic Arabidopsis showed significant drought phenotype. The results showed that GhPTPl could be involved in NaCl induced osmotic stress and Na+ stress pathway, And through participation in the content of Na+ SOS. The influence of plants. This study using yeast two hybrid screening interaction protein of more than 30 GhPTP1, including transcription factor binding proteins, these proteins, ion transport related protein. Co immunoprecipitation and tobacco transient expression test verified the interaction between GhPTP1 and GhANN5, and salt stress each other as can be induced by GhPTP1 and GhANN5.

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S562;Q943.2

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