發(fā)布時(shí)間：2018-01-03 18:15

  本文關(guān)鍵詞：AIM2在鼠傷寒沙門(mén)菌感染中的作用及機(jī)制研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 緊密銜接 上皮屏障 AIM2 鼠傷寒沙門(mén)菌 腸炎 Akt

【摘要】：黑色素瘤缺乏因子AIM2是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種DNA受體,是HIN200家族成員之一,最先作為一種黑色素瘤抑制基因而被發(fā)現(xiàn)。該基因含有不穩(wěn)定的微衛(wèi)星位點(diǎn),在許多腫瘤疾病中該位點(diǎn)發(fā)生突變,導(dǎo)致AIM2基因失活、功能缺失。目前,關(guān)于AIM2功能的報(bào)道主要是作為細(xì)胞質(zhì)DNA受體,能夠與ASC和caspase-1形成炎性復(fù)合體,參與宿主對(duì)多種DNA病毒和胞內(nèi)菌的天然免疫反應(yīng)。有研究表明,沙門(mén)菌不能夠活化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞中的AIM2炎性體,AIM2在沙門(mén)菌感染中的作用尚不清楚。為了探索AIM2在沙門(mén)菌感染中的作用,更好的理解宿主對(duì)沙門(mén)菌的固有免疫反應(yīng),本課題利用AIM2基因缺失小鼠,通過(guò)沙門(mén)菌誘導(dǎo)的腸炎模型,分析AIM2在沙門(mén)菌感染中的作用,并闡明其分子調(diào)控機(jī)制,以期為沙門(mén)菌病的防治提供理論指導(dǎo)。首先,我們分別用沙門(mén)菌黏膜感染和沙門(mén)菌系統(tǒng)感染W(wǎng)T和AIM2基因缺失小鼠,分析AIM2在沙門(mén)菌感染中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIM2基因缺失小鼠對(duì)沙門(mén)菌黏膜感染更為易感,表現(xiàn)為更高的死亡率,肝臟和脾臟組織荷菌數(shù)顯著增加;表明AIM2能夠抗沙門(mén)菌感染。沙門(mén)菌進(jìn)入腸道后,打破黏膜屏障,擴(kuò)散全身引起系統(tǒng)感染。因此,兩種基因型小鼠對(duì)沙門(mén)菌黏膜感染易感性的差異可能是由于腸道屏障功能存在缺陷引起的,也可能是由于機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除能力存在差異引起的。因此,我們進(jìn)行了沙門(mén)菌的系統(tǒng)感染分析兩種基因型小鼠對(duì)細(xì)菌的清除是否存在差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沙門(mén)菌系統(tǒng)感染中,WT和AIM2缺失小鼠對(duì)沙門(mén)菌具有相似的易感性,表明兩種基因型小鼠對(duì)細(xì)菌的清除并不存在差異。以上結(jié)果提示我們可能腸道中的AIM2發(fā)揮了抗沙門(mén)菌感染的作用。因此,我們將AIM2的功能限定在腸道,并著重分析AIM2對(duì)沙門(mén)菌誘導(dǎo)腸炎的影響。為了進(jìn)一步探索AIM2是否能夠調(diào)控局部腸道免疫反應(yīng),隨后進(jìn)行沙門(mén)菌黏膜感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同野生型小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠表現(xiàn)出更為明顯的體重減輕;感染后第2天,脾臟重量增加明顯,盲腸損傷更為嚴(yán)重;盲腸,肝臟,脾臟,腸系膜淋巴結(jié)組織荷菌數(shù)顯著增加;盲腸組織炎性細(xì)胞因子釋放顯著增加;感染后第3天,4天,5天,AIM2基因缺失小鼠盲腸部位組織病理?yè)p傷更為嚴(yán)重。以上結(jié)果表明AIM2能夠限制沙門(mén)菌誘導(dǎo)的腸炎,有利于腸道穩(wěn)態(tài)的維持。腸道上皮細(xì)胞的更新對(duì)于腸道屏障的完整和腸道穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義。因此,我們隨后檢測(cè)AIM2對(duì)腸道上皮細(xì)胞更新的影響。首先,通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)盲腸上皮細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同WT小鼠相比,在未感染沙門(mén)菌的情況下,AIM2基因缺失小鼠盲腸上皮細(xì)胞增殖數(shù)量增加;而在沙門(mén)菌感染2天后,AIM2基因缺失小鼠盲腸上皮細(xì)胞增殖數(shù)量減少。隨后,通過(guò)TUNEL染色和western blot的方法,對(duì)腸上皮細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同WT小鼠相比,AIM2基因缺失小鼠在感染沙門(mén)菌后,腸上皮細(xì)胞凋亡增加。由以上結(jié)果可知,AIM2有利于腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)的維持。盡管,我們不能排除沙門(mén)菌感染后AIM2基因缺失小鼠異常的腸上皮細(xì)胞更新可能是由于過(guò)度的腸道炎癥引起的,但是在未感染沙門(mén)菌的情況下,AIM2基因缺失小鼠異常的腸上皮細(xì)胞增殖可能導(dǎo)致腸道屏障功能減弱,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的異常擴(kuò)散。為了驗(yàn)證這種可能,我們檢測(cè)感染早期,細(xì)菌穿過(guò)上皮屏障擴(kuò)散到深層組織的情況。沙門(mén)菌黏膜感染W(wǎng)T和AIM2基因缺失小鼠3小時(shí)后,AIM2基因缺失小鼠腸系膜淋巴結(jié),腸道黏膜固有層細(xì)菌數(shù)量顯著增加。由此說(shuō)明AIM2基因缺失后,腸道屏障功能減弱。為了進(jìn)一步論證這一發(fā)現(xiàn),我們?cè)隗w外Caco-2細(xì)胞系上過(guò)表達(dá)了AIM2,并檢測(cè)沙門(mén)菌穿過(guò)細(xì)胞單層的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIM2過(guò)表達(dá)后,細(xì)菌從細(xì)胞旁通路穿過(guò)單層上皮細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。由此說(shuō)明AIM2能夠促進(jìn)單層細(xì)胞屏障功能,限制細(xì)菌經(jīng)細(xì)胞旁通路擴(kuò)散。緊密銜接是細(xì)胞旁通路中一種重要的屏障結(jié)構(gòu),封閉細(xì)胞與細(xì)胞之間的縫隙。因此,我們對(duì)細(xì)胞旁緊密銜接蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)免疫熒光,western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)緊密銜接蛋白在盲腸部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在未感染沙門(mén)菌的情況下,AIM2缺失小鼠盲腸緊密銜接蛋白claudin3的表達(dá)降低,occludin的m RNA表達(dá)量降低,ZO-1的m RNA表達(dá)不受影響。隨后進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn),我們對(duì)Caco-2細(xì)胞系和過(guò)表達(dá)AIM2的Caco-2細(xì)胞系中claudin3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIM2過(guò)表達(dá)后,claudin3的表達(dá)增加,且單層細(xì)胞的跨膜電阻增加。而沙門(mén)菌感染后,claudin3的表達(dá)降低,但是AIM2過(guò)表達(dá)的Caco-2細(xì)胞中claudin3的表達(dá)水平高于Caco-2細(xì)胞。以上結(jié)果表明,AIM2能夠促進(jìn)緊密銜接蛋白的表達(dá),促進(jìn)腸道屏障功能的完整,從而限制沙門(mén)菌在腸道內(nèi)的擴(kuò)散。隨后,我們進(jìn)一步分析AIM2的這種調(diào)節(jié)作用是如何實(shí)現(xiàn)的。體外研究發(fā)現(xiàn),AIM2過(guò)表達(dá)的Caco-2細(xì)胞中,Akt的磷酸化水平增加;在沙門(mén)菌感染30 min,60 min后,Akt的磷酸化水平逐漸降低,claudin3的表達(dá)也逐漸降低,沙門(mén)菌感染120 min后,Akt磷酸化水平升高,claudin3的表達(dá)水平也隨之升高。隨后采用Akt抑制劑處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑能夠抑制AIM2介導(dǎo)的claudin3表達(dá)水平的上調(diào)和細(xì)胞跨膜電阻的增加,抑制AIM2介導(dǎo)的限制細(xì)菌穿過(guò)單層細(xì)胞作用。但是AIM2介導(dǎo)的這些作用不受caspase-1抑制劑的影響。以上結(jié)果表明,AIM2能夠通過(guò)Akt信號(hào)促進(jìn)緊密銜接蛋白的表達(dá)。終上所述,AIM2缺失后,緊密銜接蛋白表達(dá)降低,腸道屏障功能減弱,更利于沙門(mén)菌擴(kuò)散到深層組織,從而導(dǎo)致AIM2基因缺失小鼠對(duì)沙門(mén)菌誘導(dǎo)的腸炎更為易感。
[Abstract]:In order to explore the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella , it was found that the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella was not clear . In order to explore the effect of the two genotypes on the infection of Salmonella , we found that the two genotypes had a similar susceptibility to Salmonella infection . The results showed that the two genotypes of Salmonella typhimurium had a similar susceptibility to Salmonella infection . The results showed that the proliferation of intestinal epithelial cells was decreased after infection of Salmonella in mice . The results showed that in the absence of Salmonella infection , the proliferation of intestinal epithelial cells was decreased . In vitro studies have found that the level of phosphorylation is increased . After 30 min and 60 min of infection , the level of phosphorylation and the level of phosphorylation of claudin 3 are gradually decreased , and the expression of claudin 3 is increased .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S855.1

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本文編號(hào)：1375020