本文關(guān)鍵詞：桔小實蠅Tachykinin和Natalisin信號系統(tǒng)的生理功能及其藥靶潛力評估　出處：《西南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：桔小實蠅是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,由于寄主范圍廣、適應(yīng)能力強以及抗藥性發(fā)展快速等因素,對其持續(xù)防控愈發(fā)困難。神經(jīng)肽是昆蟲體內(nèi)一種重要的信號分子,通過激活G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)調(diào)控昆蟲多種生理功能,阻斷或擾亂神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的信號傳導(dǎo),能夠達到控制害蟲的目的。因此,神經(jīng)肽信號系統(tǒng)被認為是一種理想的殺蟲劑靶標。本學(xué)位論文基于桔小實蠅基因組和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法,對桔小實蠅神經(jīng)肽前體基因進行鑒定及注釋;克隆獲得2個近似神經(jīng)肽Tachykinin(Tachykinin related-peptide,TRP)和Natalisin(NTL)前體及其受體基因的cDNA序列,并解析了桔小實蠅TRP(BdTRP)和NTL(BdNTL)及其受體(BdTRPR和BdNTLR)基因結(jié)構(gòu)信息;采用實時定量PCR(qPCR)技術(shù),分析BdTRP和BdNTL及其受體在桔小實蠅體內(nèi)的時空表達模式;運用免疫組化(Immunohistochemistry)和熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization)技術(shù),定位桔小實蠅腦部表達BdTRP和BdNTL的神經(jīng)元;通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)、觸角電位(Electroantennogram,EAG)以及行為學(xué)分析技術(shù)和方法,確定桔小實蠅TRP和NTL信號系統(tǒng)承擔(dān)的具體生理功能;利用中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞表達系統(tǒng)及胞內(nèi)鈣離子流動測定技術(shù),分別對BdTRPR和BdNTLR進行功能性測定及藥理學(xué)分析,并以此建立靶向BdTRPR和BdNTLR的激動劑和拮抗劑的高通量篩選平臺;最后,利用該篩選平臺對13個神經(jīng)肽類似物進行了靶向活性篩選和評價。本論文主要研究結(jié)果如下:1桔小實蠅神經(jīng)肽前體基因的鑒定及注釋基于桔小實蠅基因組和中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定及注釋了39個桔小實蠅的神經(jīng)肽前體基因。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),桔小實蠅大多數(shù)神經(jīng)肽前體具有典型的結(jié)構(gòu)特征,即“信號肽+成熟肽+前體相關(guān)肽”;成熟肽的切割位點保守,一般為賴氨酸殘基(K)和精氨酸殘基(R)組合;大多數(shù)成熟肽C端具有酰胺化修飾位點。此外,Adipokinetic hormone、Allatostatin C(AST-C)、Corazonin和Diuretic hormone 44成熟肽的N端存在谷氨酸環(huán)化形成的焦谷氨酸;AST-C、Allatostatin CC(AST-CC)、Crustacean cardioactive peptide、CCHamide、CNMamide、Insulin-like peptide和Neuroparsin成熟肽的半胱氨酸之間存在二硫鍵;Sulfakinin成熟肽具有1個硫酸化的酪氨酸;CNMamide、Ion transport peptide和Orcokinin的前體基因存在選擇性剪接現(xiàn)象;神經(jīng)肽Neuropeptide F存在基因復(fù)制現(xiàn)象。利用巢氏PCR技術(shù),克隆獲得了桔小實蠅BdTRP和BdNTL前體基因以及相應(yīng)受體基因的cdna序列。序列分析結(jié)果表明bdtrp和bdntl前體均具有神經(jīng)肽保守的結(jié)構(gòu)特征,其中bdtrp前體含有5個成熟肽。除bdtrp5外,其余4個成熟肽序列均具有昆蟲trp保守的基序fxgxramide。bdntl前體含有3個成熟肽,成熟肽序列均具有昆蟲ntl保守基序fxxxramide,與trp基序具有一定的相似性。此外,bdtrpr和bdntlr均有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,為典型的g蛋白偶聯(lián)受體,且與其它昆蟲相應(yīng)受體序列相比,跨膜結(jié)構(gòu)域序列高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,節(jié)肢動物trpr和ntlr明顯聚為兩個分支。2桔小實蠅trp信號系統(tǒng)的功能研究利用qpcr技術(shù)解析桔小實蠅bdtrp和bdtrpr的時空表達模式。結(jié)果表明,bdtrp和bdtrpr均在桔小實蠅的成蟲期表達水平相對較高,在幼蟲和蛹期的表達水平相對較低;值得注意的是,卵期bdtrpr的表達水平最高,而bdtrp的表達水平相對較低。桔小實蠅bdtrp和bdtrpr組織特異性的表達模式分析結(jié)果表明,bdtrp主要在桔小實蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)和中腸高水平表達,而其受體bdtrpr在成蟲組織中的表達較為廣泛,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、后腸及觸角均能檢測到表達。利用免疫組化和熒光原位雜交技術(shù),分別在蛋白和mrna水平對桔小實蠅成蟲腦部分泌bdtrp的神經(jīng)元進行定位分析。免疫組化分析結(jié)果顯示,在蛋白水平,桔小實蠅成蟲腦部有多對神經(jīng)元分泌bdtrp。在前腦區(qū)域,背外側(cè)中間神經(jīng)元(dorsolateralinterneuron,dli)和前腦后部背外側(cè)神經(jīng)元(posteriordorsolateralprotocerebrumneuron,pdlp)各有1對神經(jīng)元分泌bdtrp。在后腦區(qū)域,有1對后腦神經(jīng)元簇分泌bdtrp。在咽下神經(jīng)節(jié)區(qū)域,有1對神經(jīng)元分泌bdtrp。此外,在前腦中上部區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量被熒光標記的神經(jīng)纖維。與此同時,桔小實蠅腦部觸角神經(jīng)葉外側(cè)有9對局部中間神經(jīng)元(localinterneuron,ln)分泌bdtrp。原位雜交分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在mrna水平標記到表達bdtrp的神經(jīng)元少于免疫組化分析中定位的神經(jīng)元,分別有1對dli和2對前腦背外側(cè)神經(jīng)元(dorsolateralprotocerebrumneuron,dlp)表達bdtrp。值得一提的是,在ln發(fā)現(xiàn)有bdtrp表達,這與免疫組化分析結(jié)果相對應(yīng)。此外,bdtrp在桔小實蠅幼蟲腦部免疫組化分析結(jié)果顯示,桔小實蠅幼蟲的腦部有4對神經(jīng)元分泌bdtrp,而熒光原位雜交分析結(jié)果顯示,僅1對神經(jīng)元表達bdtrp。利用rnai、eag以及y型管行為分析技術(shù)和方法,研究trp信號系統(tǒng)對桔小實蠅嗅覺敏感性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射dsrna能夠有效干擾靶基因的表達水平,靶基因沉默效率介于62.3-68.4%。eag分析結(jié)果表明,在干擾bdtrp或bdtrpr的表達后,桔小實蠅成蟲對10%乙酸乙酯的eag反應(yīng)均顯著低于對照。y型管行為分析結(jié)果表明,對照組桔小實蠅成蟲對10%乙酸乙酯的反應(yīng)表現(xiàn)為排斥,而干擾bdtrp或bdtrpr的表達后桔小實蠅成蟲對10%乙酸乙酯的反應(yīng)由排斥轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機選擇。由此可見,trp信號系統(tǒng)能夠調(diào)控桔小實蠅的嗅覺敏感性,說明該神經(jīng)肽信號系統(tǒng)具有顯著的控制劑靶標潛力。3桔小實蠅ntl信號系統(tǒng)的功能研究利用qpcr技術(shù)解析桔小實蠅bdntl和bdntlr的時空表達模式。結(jié)果表明,bdntl和bdntlr均在蛹和成蟲期的表達水平相對較高,在幼蟲期的表達水平相對較低,卵期bdntl的表達水平最高,而其受體bdntlr的表達水平則較低。桔小實蠅bdtrp和bdtrpr組織特異性的表達模式分析結(jié)果表明,bdntl主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高水平表達,而其受體bdntlr除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達外,在后腸、觸角、卵巢和精巢也有一定的表達水平。利用免疫組化和熒光原位雜交技術(shù),分別在蛋白和mrna水平對桔小實蠅成蟲腦部分泌bdntl的神經(jīng)元進行定位分析。免疫組化分析結(jié)果顯示,在蛋白水平,桔小實蠅成蟲的腦部有13對神經(jīng)元分泌bdntl。其中,dlp和前腦間部小神經(jīng)元各有2對神經(jīng)元分泌bdntl,pdlp有7對神經(jīng)元分泌bdntl。此外,在前背外側(cè)中間神經(jīng)元(anteriordorsolateralinterneuron,adli)和下對側(cè)中間神經(jīng)元(inferiorcontralateralinterneuron,icli)各有1對神經(jīng)元分泌bdntl。熒光原位雜交結(jié)果顯示,在mrna水平,發(fā)現(xiàn)在dlp、adli和icli各有1對神經(jīng)元表達bdntl。在幼蟲腦部表達bdntl的神經(jīng)元較少,免疫組化分析結(jié)果顯示,在幼蟲腦部有6對神經(jīng)元分泌bdntl,而熒光原位雜交分析結(jié)果顯示幼蟲腦部僅有2對神經(jīng)元表達bdntl。利用rnai技術(shù),研究ntl信號系統(tǒng)對桔小實蠅交配率、產(chǎn)卵量以及卵巢和精巢發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射dsrna能夠有效干擾靶基因的表達水平,靶基因沉默效率介于51.0-81.6%。桔小實蠅雌蟲或雄蟲經(jīng)dsrna-ntl處理后,其交配率均顯著降低。但是,雌蟲產(chǎn)卵量以及卵巢或精巢的發(fā)育程度并未受到明顯影響。對其受體bdntlr進行有效干擾后,桔小實蠅成蟲的交配率同樣顯著降低。綜上所述,ntl信號系統(tǒng)對桔小實蠅產(chǎn)卵量以及卵巢或精巢的發(fā)育并無明顯影響,但能夠影響桔小實蠅成蟲的交配率,說明該神經(jīng)肽信號系統(tǒng)亦具有顯著的控制劑靶標潛力。4桔小實蠅trpr與ntlr受體的激動劑和拮抗劑篩選利用cho細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)對桔小實蠅trp和ntl受體的功能性表達,采用細胞內(nèi)鈣離子流動測定的方法建立兩個受體的功能測定體系。利用該技術(shù)體系,測定了TRP和NTL受體各自內(nèi)源配體的有效中濃度(50%effective concentration,EC50),并以此確定各自的模式配體。結(jié)果顯示,BdTRP5為BdTRPR的模式配體,BdNTL2為BdNTLR的模式配體�；钚詼y定結(jié)果表明,BdNTL2能在1μM濃度下完全激活BdTRPR,而同樣濃度的BdTRP5也能完全激活BdNTLR,說明在離體條件下,兩個信號系統(tǒng)間存在交互效應(yīng)。進一步利用該技術(shù)體系搭建靶向BdTRPR和BdNTLR的激動劑和拮抗劑的高通量篩選平臺,對13個NTL/TRP類似物進行激動劑和拮抗劑活性測定。結(jié)果表明,13個化合物均無靶向BdNTLR的有效激動劑或拮抗劑的活性�；衔�1888[Φ1]wp-4和2120[Φ1]wp-1具有明顯的靶向BdTRPR的激動劑活性,且對BdTRPR的激活能力呈濃度依賴性關(guān)系,EC50值分別為4.9 nM和268.8 nM�；衔�1887[Φ1]wp-3具有靶向BdTRPR的中度拮抗活性,且拮抗活性呈濃度依賴性關(guān)系,抑制中濃度(50%inhibitory concentration)為0.57μM。綜合分析,本學(xué)位論文研究成果不僅豐富了昆蟲神經(jīng)肽的信息,促進了神經(jīng)肽信號系統(tǒng)對昆蟲行為調(diào)控的神經(jīng)生理學(xué)機制的理解,還為靶向神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的新型控制劑的創(chuàng)制提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433

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本文編號：1355021