發(fā)布時間：2017-12-26 12:06

  本文關(guān)鍵詞：宿根矮化病病原菌特性及其侵染后的甘蔗生理和基因差異表達　出處：《廣西大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：甘蔗宿根矮化病是各個植蔗區(qū)普遍發(fā)生的病害,是甘蔗產(chǎn)量重要的限制因素之一,嚴重影響甘蔗生長,尤其是宿根蔗,造成甘蔗生產(chǎn)的經(jīng)濟損失。在高感品種上的發(fā)病率達93%,由此產(chǎn)生的甘蔗產(chǎn)量損失達27%。目前并沒有有效的藥劑來防治此病,最經(jīng)濟有效的防治措施是種植抗病品種,但至今并沒有完全有效的抗病品種。此病由革蘭氏陽性菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起,Lxx在體外培養(yǎng)需要豐富的營養(yǎng)、特制的培養(yǎng)基,是公認的難于實現(xiàn)體外培養(yǎng)的致病細菌,因此也限制了 Lxx與寄主間互作機理的研究。本研究從高感品種Badila中分離培養(yǎng)得到Lxx純培養(yǎng)物,電子顯微鏡觀察了 Lxx內(nèi)外部形態(tài)特征,利用高通量測序技術(shù)比較了與巴西菌株LxxCTCB07的基因組差異,并觀察了自然染病條件下葉片的解剖結(jié)構(gòu)和葉綠體形態(tài);利用分離培養(yǎng)的Lxx純培養(yǎng)物接種健康脫毒甘蔗,比較染病與健康蔗株間光合作用、防御酶活性、內(nèi)源激素以及基因表達上的差異,結(jié)果如下:1.用MSC培養(yǎng)基從高感品種中分離培養(yǎng)得到Lxx,經(jīng)16S-23S基因間區(qū)序列上的特異性引物PCR擴增、測序比對后確認分離培養(yǎng)物是Lxx,并命名為LxxGXBZ01,將擴增片段上傳至NCBI,登錄號為KR132244。在掃描電鏡下觀察到Lxx菌體定殖于導(dǎo)管紋孔及孔壁中,許多圓形顆粒狀物質(zhì)粘附于導(dǎo)管內(nèi)的紋孔及導(dǎo)管壁。用石蠟切片方法觀察+1葉橫切面,發(fā)現(xiàn)染病葉片的泡狀細胞圓潤,上窄下寬,相比于健康葉片的要大一些。用透射電鏡觀察葉片的葉綠體,發(fā)現(xiàn)染病葉片的葉綠體較小,形態(tài)從長橢圓形轉(zhuǎn)變成短橢圓形;基粒片層和類囊體結(jié)構(gòu)無明顯變化,但嗜鋨顆粒增加,淀粉粒減少,葉綠體被膜被破壞。2.收集LxxGXBZ01菌體,提取基因組DNA,通過Illumina Hiseq2000平臺測序,共產(chǎn)出262 M數(shù)據(jù),得到基因組大小為2446908 bp,GC含量67.94%,共有82個scaffold,2724 個 contig,scaffold 和 contig 的 N50 分別為 53480 bp、1088 bp;N90 分別為 15639 bp、405 bp。上傳至NCB1,登錄號為LFYU00000000。以巴西分離得到的菌株LxxCTCB07(登錄號:AE16822.1)的基因組全序列作為參考序列,進行比較基因組分析,得到覆蓋度為99.99%,平均深度為130。LxxGXBZ01基因組中共有13個SNP,其中同義突變3個,非同義突變2個,2個插入突變,6個缺失突變,發(fā)生在CDS的移碼突變有2個。利用EzBioclound在線軟件分析了 LxxGXBZO1與LxxCTCB07的ANI值,為93.61%,說明兩個菌株間有較高的相似性。3.用Lxx純培養(yǎng)菌液接種健康脫毒的Badila、GT11和GT29種莖,結(jié)果表明,受Lxx侵染后,品種GT11和Badila的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳和蒸騰速率隨著侵染時間的不同而呈現(xiàn)不同的下降趨勢;品種GT29染病葉片的PEPC活性降低;而Lxx對O2·-含量、SOD和POD活性的影響,因不同的甘蔗品種和不同的接種時間而有不同的變化。染病蔗汁中的Brix與健康蔗汁無差異。4.分別在新植期和宿根期的甘蔗工藝成熟期,分析了 GT11和Badila受Lxx侵染后的新植和宿根蔗莖基部和葉片中赤霉素、脫落酸和吲哚乙酸含量的情況。結(jié)果表明,Lxx侵染后,GT11新植蔗莖中的GA3、ABA含量顯著升高,宿根蔗莖中的GA3、ABA含量顯著降低,而IAA顯著升高;新植蔗葉片中的GA3、IAA含量顯著降低,宿根蔗葉片中的GA3顯著升高。Badila新植蔗莖中的ABA、IAA含量顯著下降,宿根蔗莖中ABA含量顯著降低、IAA含量顯著升高;新植蔗葉片中GA3、IAA含量顯著降低,宿根蔗葉片中GA3、ABA、IAA含量均無明顯差異。這說明Lxx對甘蔗內(nèi)源激素的影響因品種、部位、種植年限不同而有差異,且甘蔗對Lxx脅迫的響應(yīng)涉及多種激素間的相互作用。5.用Lxx純培養(yǎng)菌液接種健康脫毒的Badila種莖,分別于接種60 d、90 d后,砍取莖基部,提取RNA并構(gòu)建RNA-seq測序文庫,隨后在IlliminaHiseq平臺上進行測序,結(jié)果共得到299199個轉(zhuǎn)錄本和156713個Unigene,轉(zhuǎn)錄本和Unigene的N50分別為1875 bp和1348 bp,N90分別為442 bp和279 bp。健康與染病蔗株間在處理60 d后共有37個差異表達基因,染病蔗株上調(diào)基因9個,下調(diào)基因28個;處理90 d后共有371個差異表達基因,染病蔗株上調(diào)基因267個,下調(diào)基因104個。這些差異基因中與植物抗逆響應(yīng)關(guān)系密切的Pathway有苯丙烷代謝,萜類化合物生物合成,植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo),谷胱甘肽代謝,ABC轉(zhuǎn)運蛋白,苯丙氨酸、色氨酸、絡(luò)氨酸生物合成,半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等等,說明甘蔗通過多條代謝途徑在響應(yīng)Lxx的脅迫,是一個綜合復(fù)雜的響應(yīng)過程。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.661

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本文編號：1337170