本文關(guān)鍵詞：新型Toll樣受體7激動劑抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種以豬為唯一天然宿主的烈性傳染性病毒,主要危害母豬的繁殖和仔豬的呼吸功能,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。該病毒感染豬后能造成機體的免疫抑制,形成持續(xù)性感染,并容易誘發(fā)繼發(fā)性感染。PRRSV的變異速率高,幾乎每年都有新毒株的出現(xiàn),這給PRRSV的防控帶來了巨大的困難。目前,已有的商品化PRRSV疫苗對豬群并不能提供持續(xù)有效的保護作用�？共《警煼榭共《靖腥咎峁┝艘粋�強有力的工具,尤其對于像PRRSV這樣難以用疫苗控制的病毒。因此,抗病毒藥物干預(yù)可能成為防控PRRSV的備選方法之一。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的模式識別受體,能夠特異性識別病原體上的病原相關(guān)分子模式,在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。TLR7是TLRs家族的重要成員之一,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞上,定位于細(xì)胞質(zhì)的胞內(nèi)體中。TLR7能夠被其特異性配體所激活,通過招募下游接頭分子進行信號的級聯(lián)傳遞,激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IFN regulatory factor 7,IRF7)等,從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和干擾素的產(chǎn)生發(fā)揮抗病毒作用。前期我們合成了一種水溶性的新型TLR7激動劑SZU101,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果,我們推測其可能具有抗病毒的潛力。本研究選擇原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)為體外研究模型,探討了SZU101對PRRSV的抑制作用以及作為免疫佐劑的潛力。主要取得的結(jié)果如下:1.用不同濃度的SZU101作用PAM細(xì)胞后接種病毒,通過IFA和qPCR的方法分別從蛋白和基因水平檢測細(xì)胞內(nèi)病毒的增殖情況。結(jié)果表明SZU101以濃度梯度依賴的方式抑制PRRSV在PAM細(xì)胞中的增殖。同時,培養(yǎng)上清中子代病毒滴度的下降進一步證明了SZU101對PRRSV的抑制作用。通過檢測SZU101對CH-1a、JXA1、GD-HD和VR2332四種不同毒株在PAM細(xì)胞中增殖的抑制作用,證明了SZU101對PRRSV的抑制作用無毒株特異性。2.將SZU101與PRRSV直接混合后進行孵育,檢測其對病毒感染力的直接影響,結(jié)果表明SZU101不能通過直接與PRRSV相互作用而影響其感染力。收集用SZU101作用PAM細(xì)胞后的培養(yǎng)上清,用該培養(yǎng)上清孵育Marc-145細(xì)胞后再進行接毒,檢測到該培養(yǎng)上清具有抗病毒活性,提示SZU101在PAM細(xì)胞中誘導(dǎo)了抗病毒因子的產(chǎn)生。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn),SZU101作用PAM細(xì)胞后顯著誘導(dǎo)了干擾素(IFN-β和IFN-γ)和炎性細(xì)胞因子(IL-12p40、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá),同時也誘導(dǎo)了IRF7以及IFN刺激基因ISG15和IFIT1的表達(dá)。3.通過western blot方法檢測NF-κB的活化狀態(tài),結(jié)果表明SZU101作用PAM細(xì)胞后以濃度梯度依賴的方式激活了NF-κB并抑制了PRRSV的增殖。用抑制劑廢除TLR7的功能后,SZU101對NF-κB的激活作用和對PRRSV的抑制作用被消除,而且細(xì)胞因子及IFN相關(guān)基因的表達(dá)也不能被誘導(dǎo),說明SZU101對PRRSV的抑制、對NF-κB的激活和對細(xì)胞因子等的誘導(dǎo)依賴于TLR7。用特異性抑制劑抑制NF-κB功能后,SZU101對PRRSV的抑制作用以及對細(xì)胞因子和IFN相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用被反轉(zhuǎn),說明SZU101誘導(dǎo)細(xì)胞因子等的產(chǎn)生和抑制PRRSV增殖依賴于NF-κB的活化。上述結(jié)果表明至少TLR7-NF-κB信號通路的激活是SZU101發(fā)揮抗PRRSV作用所必須的。4.將SZU101與PRRSV聯(lián)合應(yīng)用免疫Balb/c小鼠,通過ELISA、淋巴細(xì)胞增殖實驗等方法檢測了SZU101對PRRSV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果表明SZU101能夠促進機體針對PRRSV產(chǎn)生的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,說明SZU101具有作為PRRSV免疫佐劑的潛力。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
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本文編號：1336948