本文關(guān)鍵詞：牛A型多殺性巴氏桿菌耐藥性分析及對部分常用藥物耐藥機(jī)制研究　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：牛A型多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病(Bovinere spiratory disease complex,BRDC)的主要病原體之一,已呈世界性流行和分布,給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病原于2008年首次在我國流行,多發(fā)于經(jīng)長途運(yùn)輸?shù)挠始茏优Ｖ胁?dǎo)致了較高的發(fā)病率和死亡率,時(shí)至今日,該病原引發(fā)的疾病并未減緩,給我國“北牛南調(diào),西牛東運(yùn)”的肉牛育肥模式提出了挑戰(zhàn)。牛A型Pm引發(fā)的疾病主要依賴抗生素的治療,但隨著藥物壓力的長時(shí)間存在,該病原已出現(xiàn)了耐藥菌。2012年,在德國分離到一株對12種常用抗菌藥物均耐藥的高度耐藥菌,為對該病原進(jìn)行耐藥性及耐藥機(jī)制研究敲響了警鐘。本研究首次對經(jīng)東北三省進(jìn)行“北牛南調(diào)”的育肥架子牛進(jìn)行跟蹤監(jiān)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),目前從我國分離的牛A型Pm對喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物存在耐藥性風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)而在基因組及轉(zhuǎn)錄組層面進(jìn)行牛A型Pm對喹諾酮類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性分子機(jī)制研究,主要試驗(yàn)結(jié)果如下:1.牛A型Pm的耐藥性分析及多重耐藥菌基因組的高通量測序本研究首次對經(jīng)東北三省進(jìn)行“北牛南調(diào)”的育肥架子牛進(jìn)行跟蹤監(jiān)測,在明確牛A型Pm的感染情況的基礎(chǔ)上,對分離菌進(jìn)行了常用藥物的敏感性檢測,進(jìn)而對所分離的耐藥菌進(jìn)行全基因組高通量測序,比較其與國外耐藥菌之間的差異,并對其耐藥菌克隆傳播風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。結(jié)果顯示,在我國六個(gè)省份的部分育肥牛養(yǎng)殖場分離到23株牛A型Pm,其已對新諾明、磺胺氯氰鈉高度耐藥;部分菌株對丁胺卡那、慶大霉素耐藥;部分菌株已逐漸對臨床常用的喹諾酮類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥性;分離菌均對氟苯尼考相對敏感。多重耐藥牛A型Pm基因組高通量測序結(jié)果顯示,其基因組上存在多個(gè)耐藥基因,可分別介導(dǎo)對甲氧芐啶、萬古霉素、春日霉素、鏈陽霉素耐藥;基因組上存在3個(gè)編碼藥物外排蛋白的基因,可分別編碼對大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類及青霉素/喹諾酮類/四環(huán)素類藥物耐藥;基因組上還存在有Ⅰ類耐藥整合子,其耐藥整合子可變區(qū)存在完整的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼序列。此外,23株臨床分離菌經(jīng)脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field Gel Electrophoresis,PFGE)分型結(jié)果顯示,共含有7個(gè)不同的PFGE圖譜,表現(xiàn)為獨(dú)特性,且部分PFGE譜型不相關(guān),證明部分菌有隨著育肥牛的異地運(yùn)輸而發(fā)生克隆傳播的風(fēng)險(xiǎn)。2.牛A型Pm喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥菌靶位突變分析針對上述臨床實(shí)際,本研究牛A型Pm對喹諾酮類藥物進(jìn)行了防耐藥變異濃度測定,對一步突變菌和體外高度耐藥菌進(jìn)行誘導(dǎo),并采用PCR技術(shù)對牛A型pm的喹諾酮類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物靶位進(jìn)行了突變分析,進(jìn)一步采用同源建模和分子對接技術(shù)對靶位突變后相關(guān)作用力的改變進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,牛a型pm促旋酶a亞基(gyra)喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(quinolone-resistantdeterminingregion,qrdr)發(fā)生單點(diǎn)突變的菌株存在耐藥性風(fēng)險(xiǎn),其防耐藥突變選擇濃度(mutantpreventionconcentration,mpc)較高,容易篩選到一步突變耐藥菌。其gyraqrdr83位(相對于大腸桿菌位點(diǎn))的絲氨酸置換成了異亮氨酸和拓?fù)洚悩?gòu)酶c亞基(parc)qrdr84位的谷氨酸置換成賴氨酸,可賦予該菌對喹諾酮類藥物的高度耐藥性。其中,突變菌gyraqrdr83位的絲氨酸被異亮氨酸置換后,導(dǎo)致環(huán)丙沙星與絲氨酸結(jié)合的雙氫鍵作用消失;突變菌parcqrdr80位和84位氨基酸發(fā)生突變后,導(dǎo)致環(huán)丙沙星與絲氨酸(80位)和谷氨酸(84位)結(jié)合的氫鍵作用消失,從而降低了該菌對藥物的敏感性。此外,牛a型pm均含有6個(gè)23srrna操縱子,其中5個(gè)操縱子的編碼方向?yàn)檎?1個(gè)操縱子的編碼方向?yàn)榉聪?各操縱子序列具有高度同源性,耐藥菌靶位突變與澳洲分離菌相似,其23srrna2059位的堿基置換(a→g)介導(dǎo)了牛a型pm對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的高度耐藥。3.亞抑菌濃度作用下藥物外排相關(guān)基因表達(dá)量分析首先,采用質(zhì)子泵能量抑制劑氰氯苯腙(carbonylcynidem-chlorophenylhydrazone,cccp)和atp能量抑制劑利血平對藥物外排系統(tǒng)在牛a型pm耐藥中所起的作用進(jìn)行初步檢測,結(jié)果顯示,在加入亞抑菌濃度質(zhì)子泵能量抑制劑cccp后,喹諾酮類耐藥菌和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌最小抑菌濃度均發(fā)生了下降,證明藥物外排系統(tǒng)在一定程度上參與了牛a型pm的耐藥,進(jìn)而以耐藥菌基因組高通量測序篩選到的3個(gè)編碼藥物外排基因?yàn)榛A(chǔ),采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測了3個(gè)基因在有藥物壓力和無藥物壓力作用下的相對表達(dá)量,并采用生物質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(multiplereactionmonitoring,mrm)對3個(gè)蛋白在藥物壓力作用下的蛋白表達(dá)量進(jìn)行了定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在亞抑菌濃度的恩諾沙星作用下,牛a型pm喹諾酮類耐藥菌mexv在基因水平和蛋白水平均顯著高于敏感菌,證明mexv可能在一定程度上介導(dǎo)了牛a型pm對喹諾酮類藥物的耐藥。4.亞抑菌濃度藥物作用下恩諾沙星、替米考星耐藥菌轉(zhuǎn)錄譜分析及耐藥相關(guān)代謝通路篩選為了對上述耐藥靶位和耐藥基因的變化進(jìn)行更深入的分析,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序(rnasequencin,rna-seq)的方法分別對亞抑菌濃度恩諾沙星和亞抑菌濃度替米考星作用下的菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析。結(jié)果顯示,牛a型pm喹諾酮類藥物耐藥菌和替米考星耐藥菌與敏感菌相比,分別存在533個(gè)、292個(gè)差異表達(dá)基因。對差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能注釋和相關(guān)代謝通路的繪制,發(fā)現(xiàn)在亞抑菌濃度恩諾沙星和替米考星作用下牛A型Pm耐藥菌的SOS應(yīng)答反應(yīng)通路中部分基因和糖酵解相關(guān)代謝通路的部分基因分別發(fā)生了顯著上調(diào)。綜上所述,從我國6個(gè)省份分離的牛A型Pm對常用藥物敏感性已下降,且耐藥性有隨育肥牛的轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。多重耐藥菌基因組中存在多個(gè)耐藥基因,但耐藥基因攜帶情況與德國分離菌存在較大差異,其整合子可變區(qū)耐藥基因盒較單一,僅存在氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶。喹諾酮類藥物耐藥菌發(fā)生了耐藥靶位的突變和藥物外排蛋白表達(dá)水平的變化,大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥菌主要發(fā)生了藥物靶位的突變。恩諾沙星和替米考星都誘導(dǎo)牛A型Pm發(fā)生了SOS應(yīng)答反應(yīng),且與其他源性細(xì)菌SOS應(yīng)答反應(yīng)調(diào)節(jié)基因有較大差別,其lexA、ssB、recO、ruvA等基因發(fā)生了顯著上調(diào),同時(shí)耐藥菌中糖酵解等代謝通路的部分基因也發(fā)生了顯著上調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：1335216