本文關鍵詞：基于轉錄組學分析研究印楝和苦楝中檸檬苦素類化合物的合成　出處：《中國林業(yè)科學研究院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：檸檬苦素類化合物是一類三萜類化合物,具有良好的生物學活性和生態(tài)學效應,能夠有效殺滅小菜蛾、菜青蟲、蝗蟲等多種農(nóng)業(yè)害蟲,是一類理想的植物源殺蟲劑。印楝和苦楝是兩種楝科植物,在進化上具有較近的親緣關系,化學成分分析表明二者均含有豐富的檸檬苦素類化合物,但種類和成分相差較大,尤其是在苦楝中基本檢測不到印楝素。因此基于兩種楝樹體內檸檬苦素構成類型不同這一現(xiàn)象,本研究運用Illumina高通量測序技術對印楝和苦楝的葉片樣本進行鏈特異性轉錄組測序,獲得了大量的基因序列信息,然后對數(shù)據(jù)進行深入的生物信息學分析,如印楝的可變剪接分析、單核苷酸多態(tài)性和插入缺失位點預測、新基因挖掘、基因結構優(yōu)化和表達量分析;苦楝的Unigenes編碼區(qū)預測、簡單重復序列分析和功能注釋;兩種楝樹直系同源基因的比較分析等,并對獲得的大量有效信息進行分析,進而篩選出檸檬苦素類化合物生物合成途徑中涉及的多個相關基因,同時進行克隆和初步表達分析。主要研究結果如下:1.通過對三個印楝樣本(Y1、Y2、Y3)分別提取總RNA、構建鏈特異性文庫和高通量測序,獲得23M、22M和28M的雙端Reads。FastQC質檢結果顯示clean reads數(shù)占raw reads數(shù)的98.2%以上,測序堿基質量值Q30達到91.44%以上,這表明測序質量較好�；谟￠瑓⒖蓟蚪M信息,有超過81.26%的reads能比對到基因組上。Mapped reads采用Cufflink進行拼接,并將拼接結果與基因組注釋結果進行比較,預測到約83,000種可變剪接情況,其中第一個和最后一個外顯子可變剪接最為常見,占總事件的80%以上。同時通過比對分析修正優(yōu)化了5037個基因結構并發(fā)現(xiàn)1179個新基因,其中1055個新基因功能被注釋。通過基因表達量分析,大多數(shù)基因FPKM值在0.1-100之間,相關系數(shù)表明三個樣本間重復性較好。此外通過GATK軟件對Mapped Reads進行分析,挖掘了72,644個SNP位點和10,368個InDel位點。將這三個樣本的轉錄組數(shù)據(jù)提交到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中,獲得了三個樣本的登錄號:Y1(SRR3180937)、Y2(SRR3181105)和Y3(SRR3181166)。2.同樣地通過對三個苦楝樣本(K1、K2、K3)的鏈特異性RNA-seq測序分析,分別獲得約26M、23M和21M的雙端reads。FastQC質檢結果顯示clean reads占raw reads的98%以上且測序堿基質量值Q30≥91.27%,測序質量較高。隨后利用Trinity將clean reads進行從頭組裝,共得到6,014,722條contig、225,972條transcript和91,607條unigene序列,其n50值分別為48、2628和1321個堿基,組裝完整性較好。利用bowtie軟件將cleanreads比對到組裝完的transcript和unigene庫中,約93%以上的reads能匹配上,說明trinity組裝效果較好。unigene潛在編碼區(qū)預測采用transdecoder軟件進行,共識別潛在的cds序列68,225條,其中25,574條序列讀碼框完整。隨后利用misa軟件對18,099條1kb以上的unigene做ssr分析,共識別含有ssr位點序列5521條,合計位點總數(shù)7338個。將unigene庫與常見數(shù)據(jù)庫進行比較分析,共有53,732條基因功能信息被注釋。通過fpkm值分析unigene表達量,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因fpkm值在0.1-100之間,且三個樣本間重復性較好。同樣將這三個樣本的轉錄組數(shù)據(jù)提交到ncbisra數(shù)據(jù)庫中,獲得了相應的登錄號:k1(srr3183379)、k2(srr3183380)和k3(srr3183381)。3.通過對兩種楝樹的蛋白序列進行同源比對,共篩選到3867對直系同源基因,隨后對這些基因的表達量進行標準化并篩選表達量相差兩倍以上的基因作為差異表達基因(differentiallyexpressedgenes,degs),共選出2478個degs,其中在印楝中有1388個基因表現(xiàn)為上調,1090個基因表現(xiàn)為下調。將degs與常見數(shù)據(jù)庫進行比對分析,共注釋到2459個degs功能信息。kegg和topgo富集分析顯示在印楝中71個顯著上調基因涉及atp結合、鏈特異性dna結合、精氨酸/絲氨酸剪接因子、蛋白酪氨酸磷酸酶、去甲酰酶、異構酶和甲基轉移酶等;281個顯著下調基因涉及光裂合酶、解旋酶、n-乙酰基轉移酶、琥珀酰轉移酶和異戊烯基轉移酶等。kegg注釋完成后對印楝和苦楝中萜類合成相關基因進行篩選,在印楝中分別得到107、24、74和30條基因序列參與萜類骨架、單萜、二萜、倍半萜和三萜的生物合成過程,而苦楝中分別有135、29、50和27條unigenes參與了上述生物合成,同時涉及上述萜類合成過程的degs分別為6、2、3和1條。對12條萜類合成相關的degs進行進一步分析發(fā)現(xiàn)6條參與萜類骨架合成的基因在印楝中表達上調,說明印楝中總體萜類合成明顯比苦楝活躍,這與化學成分分析中印楝總萜含量(2.45%)高于苦楝總萜含量(1.67%)相一致。而涉及單萜、二萜和三萜合成中的6條degs有5條在印楝中表達下調如β-香樹精合成酶、薄荷醇脫氫酶、貝殼杉烯酸脫氫酶和赤霉素氧化酶,僅貝殼杉烯氧化酶基因表達上調。4.通過分子生物學技術成功克隆了26條檸檬苦素合成相關基因,其中印楝6條,分別為aidxr、aifpps、aihmgs、aihmgr、aiipi和aiss;苦楝20條,分別為madxr、MaHMGS、MaIDS、MaHMGR、MaATCC、MaMK、MaCMK、MaMDC、MaSS、MaDXS1、MaDXS2、MaHDS、MaMECPS、MaIPI、MaGGPPS1、MaGGPPS2、MaGGPPS3、MaSQLE1、MaSQLE2和MaGPPS。選取了印楝素合成的最近關鍵基因AiSS構建原核表達載體pET32a-AiSS并在Escherichia coli BL21(DE3)進行蛋白表達,結果發(fā)現(xiàn)表達蛋白以包涵體形式存在于沉淀組分中,隨后構建真核表達載體pPICZαA-AiSS并在Pichia pastoris GS115進行表達,雖然成功篩選到陽性克隆,但未能在發(fā)酵液上清中獲得表達蛋白,這可能是AiSS在N端有膜定位信號,在分泌到胞外的過程中被截留到膜上。對這26條基因的成功克隆不僅幫助我們了解楝樹體內檸檬苦素的生物合成途徑,還可以通過對其進行蛋白表達和功能分析,改造并篩選出高產(chǎn)鯊烯的工程菌,為今后檸檬苦素的規(guī)�；a(chǎn)奠定基礎。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S792.33

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 盧虹玉;劉敬梅;張海超;高山林;;烏拉爾甘草轉鯊烯合成酶基因毛狀根系研究[J];中國中藥雜志;2009年15期

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1 熊翼;印楝油微乳的制備及其體外殺螨活性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2008年

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本文編號：1324792