本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究印楝和苦楝中檸檬苦素類化合物的合成　出處：《中國林業(yè)科學(xué)研究院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：檸檬苦素類化合物是一類三萜類化合物,具有良好的生物學(xué)活性和生態(tài)學(xué)效應(yīng),能夠有效殺滅小菜蛾、菜青蟲、蝗蟲等多種農(nóng)業(yè)害蟲,是一類理想的植物源殺蟲劑。印楝和苦楝是兩種楝科植物,在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系,化學(xué)成分分析表明二者均含有豐富的檸檬苦素類化合物,但種類和成分相差較大,尤其是在苦楝中基本檢測不到印楝素。因此基于兩種楝樹體內(nèi)檸檬苦素構(gòu)成類型不同這一現(xiàn)象,本研究運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)對印楝和苦楝的葉片樣本進(jìn)行鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了大量的基因序列信息,然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析,如印楝的可變剪接分析、單核苷酸多態(tài)性和插入缺失位點(diǎn)預(yù)測、新基因挖掘、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化和表達(dá)量分析;苦楝的Unigenes編碼區(qū)預(yù)測、簡單重復(fù)序列分析和功能注釋;兩種楝樹直系同源基因的比較分析等,并對獲得的大量有效信息進(jìn)行分析,進(jìn)而篩選出檸檬苦素類化合物生物合成途徑中涉及的多個相關(guān)基因,同時進(jìn)行克隆和初步表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:1.通過對三個印楝樣本(Y1、Y2、Y3)分別提取總RNA、構(gòu)建鏈特異性文庫和高通量測序,獲得23M、22M和28M的雙端Reads。FastQC質(zhì)檢結(jié)果顯示clean reads數(shù)占raw reads數(shù)的98.2%以上,測序堿基質(zhì)量值Q30達(dá)到91.44%以上,這表明測序質(zhì)量較好�；谟￠瑓⒖蓟蚪M信息,有超過81.26%的reads能比對到基因組上。Mapped reads采用Cufflink進(jìn)行拼接,并將拼接結(jié)果與基因組注釋結(jié)果進(jìn)行比較,預(yù)測到約83,000種可變剪接情況,其中第一個和最后一個外顯子可變剪接最為常見,占總事件的80%以上。同時通過比對分析修正優(yōu)化了5037個基因結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)1179個新基因,其中1055個新基因功能被注釋。通過基因表達(dá)量分析,大多數(shù)基因FPKM值在0.1-100之間,相關(guān)系數(shù)表明三個樣本間重復(fù)性較好。此外通過GATK軟件對Mapped Reads進(jìn)行分析,挖掘了72,644個SNP位點(diǎn)和10,368個InDel位點(diǎn)。將這三個樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提交到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中,獲得了三個樣本的登錄號:Y1(SRR3180937)、Y2(SRR3181105)和Y3(SRR3181166)。2.同樣地通過對三個苦楝樣本(K1、K2、K3)的鏈特異性RNA-seq測序分析,分別獲得約26M、23M和21M的雙端reads。FastQC質(zhì)檢結(jié)果顯示clean reads占raw reads的98%以上且測序堿基質(zhì)量值Q30≥91.27%,測序質(zhì)量較高。隨后利用Trinity將clean reads進(jìn)行從頭組裝,共得到6,014,722條contig、225,972條transcript和91,607條unigene序列,其n50值分別為48、2628和1321個堿基,組裝完整性較好。利用bowtie軟件將cleanreads比對到組裝完的transcript和unigene庫中,約93%以上的reads能匹配上,說明trinity組裝效果較好。unigene潛在編碼區(qū)預(yù)測采用transdecoder軟件進(jìn)行,共識別潛在的cds序列68,225條,其中25,574條序列讀碼框完整。隨后利用misa軟件對18,099條1kb以上的unigene做ssr分析,共識別含有ssr位點(diǎn)序列5521條,合計位點(diǎn)總數(shù)7338個。將unigene庫與常見數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析,共有53,732條基因功能信息被注釋。通過fpkm值分析unigene表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因fpkm值在0.1-100之間,且三個樣本間重復(fù)性較好。同樣將這三個樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提交到ncbisra數(shù)據(jù)庫中,獲得了相應(yīng)的登錄號:k1(srr3183379)、k2(srr3183380)和k3(srr3183381)。3.通過對兩種楝樹的蛋白序列進(jìn)行同源比對,共篩選到3867對直系同源基因,隨后對這些基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并篩選表達(dá)量相差兩倍以上的基因作為差異表達(dá)基因(differentiallyexpressedgenes,degs),共選出2478個degs,其中在印楝中有1388個基因表現(xiàn)為上調(diào),1090個基因表現(xiàn)為下調(diào)。將degs與常見數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,共注釋到2459個degs功能信息。kegg和topgo富集分析顯示在印楝中71個顯著上調(diào)基因涉及atp結(jié)合、鏈特異性dna結(jié)合、精氨酸/絲氨酸剪接因子、蛋白酪氨酸磷酸酶、去甲酰酶、異構(gòu)酶和甲基轉(zhuǎn)移酶等;281個顯著下調(diào)基因涉及光裂合酶、解旋酶、n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰轉(zhuǎn)移酶和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶等。kegg注釋完成后對印楝和苦楝中萜類合成相關(guān)基因進(jìn)行篩選,在印楝中分別得到107、24、74和30條基因序列參與萜類骨架、單萜、二萜、倍半萜和三萜的生物合成過程,而苦楝中分別有135、29、50和27條unigenes參與了上述生物合成,同時涉及上述萜類合成過程的degs分別為6、2、3和1條。對12條萜類合成相關(guān)的degs進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)6條參與萜類骨架合成的基因在印楝中表達(dá)上調(diào),說明印楝中總體萜類合成明顯比苦楝活躍,這與化學(xué)成分分析中印楝總萜含量(2.45%)高于苦楝總萜含量(1.67%)相一致。而涉及單萜、二萜和三萜合成中的6條degs有5條在印楝中表達(dá)下調(diào)如β-香樹精合成酶、薄荷醇脫氫酶、貝殼杉烯酸脫氫酶和赤霉素氧化酶,僅貝殼杉烯氧化酶基因表達(dá)上調(diào)。4.通過分子生物學(xué)技術(shù)成功克隆了26條檸檬苦素合成相關(guān)基因,其中印楝6條,分別為aidxr、aifpps、aihmgs、aihmgr、aiipi和aiss;苦楝20條,分別為madxr、MaHMGS、MaIDS、MaHMGR、MaATCC、MaMK、MaCMK、MaMDC、MaSS、MaDXS1、MaDXS2、MaHDS、MaMECPS、MaIPI、MaGGPPS1、MaGGPPS2、MaGGPPS3、MaSQLE1、MaSQLE2和MaGPPS。選取了印楝素合成的最近關(guān)鍵基因AiSS構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-AiSS并在Escherichia coli BL21(DE3)進(jìn)行蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白以包涵體形式存在于沉淀組分中,隨后構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA-AiSS并在Pichia pastoris GS115進(jìn)行表達(dá),雖然成功篩選到陽性克隆,但未能在發(fā)酵液上清中獲得表達(dá)蛋白,這可能是AiSS在N端有膜定位信號,在分泌到胞外的過程中被截留到膜上。對這26條基因的成功克隆不僅幫助我們了解楝樹體內(nèi)檸檬苦素的生物合成途徑,還可以通過對其進(jìn)行蛋白表達(dá)和功能分析,改造并篩選出高產(chǎn)鯊烯的工程菌,為今后檸檬苦素的規(guī)�；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S792.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 熊翼;印楝油微乳的制備及其體外殺螨活性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

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