本文關(guān)鍵詞：巴氏新小綏螨高溫品系篩選及其適應性機制研究　出處：《西南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：植綏螨是一類具有捕食能力的螨類,利用植綏螨控制農(nóng)業(yè)害蟲害螨是有害生物綠色防控的一項重要措施。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,多數(shù)農(nóng)業(yè)害螨,如二斑葉螨Tetranychus urticae、柑橘全爪螨Panonychus citri、山楂葉螨T.viennensis等為高溫活動型葉螨,適度高溫環(huán)境會加重該類型葉螨的發(fā)生與危害,而植綏螨對高溫環(huán)境相對敏感,且商業(yè)化植綏螨大多是在25°C恒溫條件下飼養(yǎng)獲得。我國長江中下游和西南、華南地區(qū),夏季6-8月日均溫高于30°C的高溫天數(shù)可能持續(xù)十幾天甚至數(shù)十天,商業(yè)化植綏螨釋放到田間后,即使在獵物相當充足的狀況下,植綏螨種群數(shù)量仍增長較慢而失去對害螨的控制作用。同時全球氣候變暖、極端天氣頻繁發(fā)生也是制約植綏螨在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中持續(xù)控制害螨、發(fā)揮其生物防治效能的重要因素。因此,如何提高商業(yè)化植綏螨天敵產(chǎn)品的耐熱性,使其在高溫環(huán)境下仍具有高效、持續(xù)控制害蟲害螨潛能,已成為當前利用植綏螨進行生物防治時最需要迫切解決的科技問題。巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri Hughes(Acari:Phytoseiidae)作為我國唯一已商業(yè)化生產(chǎn)的本土植綏螨種類,近年來在農(nóng)業(yè)害蟲害螨綠色防控中發(fā)揮了重要作用。然而,巴氏新小綏螨N.barkeri商業(yè)化品系由于長期飼養(yǎng)在最適溫度環(huán)境中,釋放到田間后因適應性差,使得控害效能嚴重縮水。因此,巴氏新小綏螨N.barkeri商業(yè)化品系抗逆性有待進一步加強。本學位論文以巴氏新小綏螨N.barkeri為研究對象,通過長期高溫馴化(中等高溫:35°C)與高溫鍛煉(45°C暴露2 h),篩選獲得了巴氏新小綏螨N.barkeri高溫品系,并對其生物生態(tài)學、生理學以及分子生物學的適應機理進行了評價,為高溫環(huán)境下高效利用該螨控制靶標害蟲害螨提供了理論依據(jù)與實踐基礎。通過近4年的研究,取得了如下研究結(jié)果:1高溫脅迫對巴氏新小綏螨生物生態(tài)學的影響1.1巴氏新小綏螨常溫品系與高溫品系的建立商業(yè)化植綏螨多系為最適溫區(qū)飼養(yǎng)、繁殖與規(guī)�；a(chǎn)。本學位論文將恒溫25°C環(huán)境中飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨N.barkeri實驗種群視為常溫品系(conventional strain,CS),該品系亦可被視為商業(yè)化品系(commercial strain,CS)。為篩選獲得巴氏新小綏螨N.barkeri高溫品系(high temperature adapted strain,HTAS),本學位論文設定了“高溫鍛煉—高溫馴化—高溫再鍛煉—高溫再馴化”的長期篩選模式。巴氏新小綏螨N.barkeri長期高溫馴化飼養(yǎng)溫度為35°C;高溫鍛煉過程,即每馴化飼養(yǎng)15-20 d后于45°C暴露1次,每次暴露約2-4 h。截止到本學位論文開展試驗測定生物生態(tài)學、生理學以及分子生物學等適應性評價時,巴氏新小綏螨N.barkeri共獲得高溫鍛煉次數(shù)至少為25次,高溫馴化天數(shù)近450 d(約110代左右)。1.2巴氏新小綏螨高溫敏感性測定巴氏新小綏螨N.barkeri經(jīng)過長期高溫馴化和高溫鍛煉,對短時高溫脅迫的承受能力顯著增強。因卵殼的保護作用,巴氏新小綏螨N.barkeri卵有較強的高溫耐受能力,常溫品系和高溫品系卵在經(jīng)歷短時高溫脅迫后,其孵化率差異不顯著;兩種品系雌成螨高溫致死率均隨脅迫強度的增加(溫度和暴露時間)而顯著升高,但高溫品系在極端溫度環(huán)境中的存活時間顯著長于常溫品系(如45°C時:HTAS LT50=15.2 h遠遠長于CS LT50=1.9 h)。戶外高溫熱浪暴露8 h后,高溫品系雌成螨死亡率亦低于常溫品系雌成螨死亡率。1.3中等高溫環(huán)境中(35°C vs 25°C)巴氏新小綏螨的生殖與存活策略巴氏新小綏螨N.barkeri具有非常明顯的溫度可塑性和適應性。常溫品系在35°C環(huán)境中能夠正常生長發(fā)育、交配和繁殖,但其適合度相比室溫25°C環(huán)境明顯降低,主要表現(xiàn)為發(fā)育加快(1.63 d,占27.0%)、總產(chǎn)卵量降低(42.5粒/雌,占64.0%)和平均壽命縮短(29.7 d,占57.2%),且未成熟期死亡率增大(27.0%,占29.3%)。高溫品系無論是在室溫25°C還是在高溫35°C環(huán)境中,其發(fā)育速率均變快;25°C時,總產(chǎn)卵量和平均壽命與常溫品系無顯著差異,暗示著巴氏新小綏螨N.barkeri高溫品系在室溫環(huán)境中亦能發(fā)揮較大生殖潛能,但在高溫35°C環(huán)境中,總產(chǎn)卵量顯著低于常溫品系,說明高溫品系中存在明顯的生殖與存活權(quán)衡機制。此外,長期高溫飼養(yǎng)還可導致雌性比例降低(15.1%,占21.0%)�？傮w來講,巴氏新小綏螨N.barkeri在中等高溫環(huán)境中主要是以降低繁殖水平來換取存活空間。1.4短時高溫脅迫對巴氏新小綏螨繁殖的影響根據(jù)高溫敏感性測定結(jié)果,在實驗室內(nèi)模擬了短時高溫事件(分別在38°C和42°C處理了2 h和4 h,以室溫25°C未經(jīng)脅迫處理為對照),分批次對巴氏新小綏螨N.barkeri雌成螨(羽化后1-2 d)進行了高溫處理,并對其存活情況和生殖特性予以評價(允許雌成螨與同齡雄成螨(未經(jīng)脅迫處理)進行多次交配以獲得最大產(chǎn)卵量)。結(jié)果表明,巴氏新小綏螨N.barkeri常溫品系雌成螨經(jīng)過短時高溫脅迫處理后,產(chǎn)卵前期顯著延長、總產(chǎn)卵量顯著下降、平均壽命顯著縮短,且隨脅迫強度的增加而變得愈加明顯;高溫品系雌成螨產(chǎn)卵前期亦延長,總產(chǎn)卵量降低,但雌成螨平均壽命并未受到影響,且在42°C脅迫處理組中(2 h和4 h),高溫品系雌成螨平均壽命顯著長于常溫品系平均壽命�？紤]到巴氏新小綏螨N.barkeri屬兩性生殖方式(或假產(chǎn)雄孤雌生殖方式),本論文以常溫品系為研究對象,分別闡明了雌成螨、雄成螨分別遭遇高溫脅迫以及同時遭遇高溫脅迫后,雌雄成螨的交配行為(僅允許交配1次),各自平均壽命、總產(chǎn)卵量等是否受到高溫脅迫效應的影響,以及子代卵孵化水平即是否受到親代高溫脅迫的影響。結(jié)果表明雄性個體在種群增長過程中扮演重要角色,短時高溫脅迫亦能使雄性個體與雌性個體交配時間顯著延長;雌雄成螨分別遭遇、特別是同時遭遇高溫脅迫后,雌性個體產(chǎn)卵前期顯著延長,總產(chǎn)卵量顯著下降,但子代卵的孵化率并未受到親代效應影響。綜合分析認為,高溫脅迫對巴氏新小綏螨N.barkeri繁殖特性具有一定程度的負面影響,這可能是夏季高溫時段導致其種群退化的重要因素。1.5高溫脅迫對巴氏新小綏螨捕食功能反應的影響為明確巴氏新小綏螨N.barkeri對二斑葉螨T.urticae潛在控制能力是否受高溫脅迫效應的影響,試驗共設置2個脅迫溫度處理(38°C和42°C,以25°C為對照)和2個脅迫時間處理(2 h和4 h),分別對兩種品系雌成螨事先進行高溫脅迫處理,在室溫(25°C)環(huán)境中研究了巴氏新小綏螨N.barkeri雌成螨對二斑葉螨T.urticae若螨的捕食功能反應。無論巴氏新小綏螨N.barkeri經(jīng)歷高溫脅迫與否,兩種品系雌成螨對二斑葉螨T.urticae若螨捕食功能反應均為Holling II型。高溫脅迫后,常溫品系雌成螨對二斑葉螨T.urticae若螨捕食量(24 h)與對照相比呈現(xiàn)下降趨勢,瞬時攻擊率(a)降低,處理時間(Th)延長,對獵物控制能力(a/Th)降低,但均未隨脅迫強度而呈現(xiàn)規(guī)律性變化。高溫品系雌成螨對二斑葉螨T.urticae若螨的捕食功能反應并不受高溫脅迫的影響。高溫脅迫可能對巴氏新小綏螨N.barkeri食欲產(chǎn)生負面影響,短期內(nèi)出現(xiàn)厭食反應,但隨室溫恢復時間的延長其捕食功能可能會逐漸得到恢復。2巴氏新小綏螨抗氧化反應研究溫度脅迫能夠打破巴氏新小綏螨N.barkeri細胞內(nèi)氧化還原平衡,發(fā)生氧化脅迫。雌成螨在低溫0°C和5°C、高溫38°C和42°C環(huán)境中分別脅迫2 h和4 h,以25°C為對照,測定了巴氏新小綏螨N.barkeri兩種溫度品系雌成螨的抗氧化反應水平。研究結(jié)果表明,高溫品系雌成螨細胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶GSTs和總抗氧化能力T-AOC活性均顯著低于常溫品系,脂質(zhì)過氧化水平亦低于后者,說明抗氧化酶系統(tǒng)可能參與了巴氏新小綏螨N.barkeri高溫馴化反應。當遭遇高溫脅迫后,兩種品系SOD、CAT、POD以及GSTs活性均顯著增強,暗示著這些抗氧化酶可能以一種協(xié)同作用的方式共同參與細胞內(nèi)抗氧化過程;隨脅迫強度的增加,如42°C處理4 h后,雌成螨體內(nèi)MDA含量升高且達到最大值,暗示了抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧ROS能力有限,導致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度較高,甚至引起個體死亡。低溫脅迫(0°C)能誘導SOD等4種抗氧化酶活性上調(diào)表達,以維持細胞內(nèi)氧化還原平衡,但MDA含量僅在高溫品系雌成螨體內(nèi)累積,說明高溫品系可能對低溫脅迫較為敏感,脂質(zhì)過氧化程度較高。綜合分析表明,巴氏新小綏螨N.barkeri在高溫馴化過程中可能會盡量選擇降低能量消耗,通過協(xié)同多種抗氧化酶以應對溫度脅迫。3巴氏新小綏螨兩種品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較與分析本章基于Illumina Hi Seq?2000平臺對巴氏新小綏螨N.barkeri常溫品系和高溫品系兩個樣本進行全螨態(tài)轉(zhuǎn)錄組測序,分別獲得42,917,214和43,537,230個clean reads,經(jīng)過組裝后獲得52,776條Unigenes,分別在nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫中進行了比對注釋,共有36,951條Unigenes在上述5個數(shù)據(jù)庫得到注釋,注釋率為70%。通過對nr數(shù)據(jù)庫中成功注釋的Unigene同源性分析,發(fā)現(xiàn)有52.9%的基因與其近緣物種西方盲走螨Metaseialus occdentalis相似。巴氏新小綏螨N.barkeri經(jīng)過高溫馴化,其基因表達量在轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)了新的重組,有多達10506條Unigenes表達量發(fā)生顯著性變化,約占總數(shù)的1/5,其中有6,338條Unigenes上調(diào),4,168條Unigenes下調(diào),說明高溫環(huán)境中基因表達發(fā)生了適應性改變,相當多的基因顯著上調(diào)/下調(diào)表達。4巴氏新小綏螨熱激蛋白HSPs mRNA表達模式解析從巴氏新小綏螨N.barkeri轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到了5條與熱激蛋白基因相關(guān)的HSPs Unigenes,分別是CL1558.Contig1_All、Unigene13225_All、CL4607.Contig1_All、Unigene8871_All、Unigene861_All,通過Blastn序列比對,最終確定目的基因序列分別為Hsp90、Hsp75、Hsp70、Hsp60和Hsp40。使用在線引物設計軟件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3/),設計以上5個HSPs基因的RT-qPCR引物,以Beta actin基因作為參考基因。采用RT-qPCR技術(shù),首先明確了巴氏新小綏螨N.barkeri 5種HSPs基因在不同發(fā)育階段中的m RNA表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),常溫品系與高溫品系HSPs m RNA相對表達量均在各自不同發(fā)育階段中均存在顯著性差異。Hsp90 m RNA在常溫品系卵期和成螨階段表達量較高,但在高溫品系若螨和雌成螨體內(nèi)表達量較高;Hsp75 m RNA分別在常溫品系雌成螨和高溫品系若螨體內(nèi)表達量較高;Hsp60 m RNA在常溫品系若螨及成螨體內(nèi)表達量較低,而在高溫品系卵和雄成螨體內(nèi)表達量較低。熱激蛋白HSPs(Hsp90 m RNA和Hsp60 m RNA)在高溫品系中發(fā)生差異性表達(相較于常溫品系),暗示了這些HSPs蛋白在高溫品系馴化飼養(yǎng)過程中可能發(fā)揮了重要的生理功能。Hsp70和Hsp40作為生物體內(nèi)最為重要分子伴侶蛋白,其表達量在兩種品系中均隨發(fā)育階段而呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達趨勢。其次明確了高溫脅迫溫度(分別在38°C和42°C中處理1 h)對巴氏新小綏螨N.barkeri兩種品系5種HSPs m RNA表達模式的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高溫脅迫能誘導巴氏新小綏螨N.barkeri Hsp90 m RNA、Hsp75 m RNA、Hsp70 m RNA、Hsp60 m RNA和Hsp40 m RNA在各發(fā)育階段內(nèi)的上調(diào)表達,其表達模式具有明顯的溫度效應,即在42°C中暴露1 h時上調(diào)表達倍數(shù)最為顯著,例如常溫品系Hsp70 m RNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上調(diào)倍數(shù)分別達1258.6倍、2443.9倍、269.4倍、135.2倍和42.9倍,高溫品系Hsp70 m RNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上調(diào)倍數(shù)分別達1739.2倍、1478.9倍、215.5倍、159.9倍和45.9倍。最后明確了高溫脅迫時間(42°C中處理1 h、2 h、3 h和4h)對巴氏新小綏螨N.barkeri雌成螨5種HSPs m RNA相對表達量的影響。結(jié)果表明,常溫品系Hsp70 m RNA和Hsp40 m RNA在脅迫1 h后表達量顯著上調(diào)表達,且隨脅迫時間的延長逐步恢復至正常水平/略高于正常水平;當脅迫時間大于等于3 h時,高溫品系雌成螨Hsp70m RNA和Hsp40 m RNA表達量顯著高于常溫品系,說明Hsp70和Hsp40蛋白在高溫品系抵御高溫中起到保護作用。巴氏新小綏螨N.barkeri雌成螨Hsp90 m RNA和Hsp60 m RNA在高溫脅迫模式中的表達也遵循時間效應。綜合分析表明,巴氏新小綏螨N.barkeri HSPs在高溫馴化反應和應激脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。綜上所述,本學位論文緊密圍繞植綏螨商業(yè)化品系“田間適應能力差、控害效能低”這一突出科技問題,以巴氏新小綏螨N.barkeri為試驗材料,在通過長期高溫鍛煉與高溫馴化等方式篩選獲得其高溫品系基礎上,系統(tǒng)開展了巴氏新小綏螨N.barkeri高溫適應性機制的相關(guān)研究。在生物生態(tài)學方面,通過模擬高溫脅迫事件,發(fā)現(xiàn)巴氏新小綏螨N.barkeri高溫品系對高溫脅迫敏感程度顯著降低;高溫品系雌成螨個體存活、總產(chǎn)卵量、平均壽命以及取食量均受高溫脅迫效應影響較常溫品系小;高溫脅迫還可導致雄成螨生殖力降低。在生理層面,溫度脅迫能夠打破巴氏新小綏螨N.barkeri細胞內(nèi)氧化還原平衡,造成氧化脅迫;抗氧化酶系統(tǒng)參與了巴氏新小綏螨N.barkeri高溫馴化反應及其氧化應激過程,抵御短時高溫脅迫。在分子層面,構(gòu)建了巴氏新小綏螨N.barkeri常溫品系與高溫品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,研究結(jié)果為后期進一步揭示其高溫適應機制提供重要依據(jù);熱激蛋白HSPs在高溫馴化和應激脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果從多個層面證實,高溫馴化反應提高了巴氏新小綏螨N.barkeri常溫品系高溫耐受水平,其高溫品系將為高溫活動型農(nóng)業(yè)害螨持續(xù)防控難題奠定重要理論和實踐基礎。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S476.2
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本文編號：1324706