本文關(guān)鍵詞：Myostatin對豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞成脂分化的調(diào)控機制研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肌內(nèi)脂肪含量影響著豬肉的感官品質(zhì)性狀(多汁性、嫩度和風(fēng)味等),同時它也與人類的胰島素耐受性等疾病密切相關(guān)。存在于肌肉中的兩種干細胞群體(脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞)均具有分化為脂肪細胞的特性,但是肌內(nèi)脂肪細胞主要來源于哪種細胞并未得到證實。Myostatin(MSTN)是由肌細胞分泌的、對肌肉生長起負調(diào)控作用的分泌性蛋白,屬于TGF-β超家族。本課題組前期的研究結(jié)果表明,MSTN處理肌衛(wèi)星細胞后其脂肪分化潛能受到抑制,但是MSTN處理后的脂肪來源干細胞分化潛能卻未受到抑制,由此推測：肌內(nèi)脂肪細胞可能主要來源于脂肪來源干細胞。但是,MSTN如何對這兩種細胞的成脂分化發(fā)揮不同的調(diào)控作用的機制仍是未知的,肌內(nèi)脂肪細胞主要來源于脂肪來源干細胞的推測也未得到證實。為了解決以上問題,本論文主要開展兩方面研究：首先用MSTN蛋白分別處理豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞,比較肌肉生長發(fā)育關(guān)鍵基因成肌分化因子1(myogenic differentiation factor 1, MyoD)和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因過氧化物酶體增殖激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor y, PPARy)在MSTN處理前后的表達情況；探討MyoD對PPARy基因的調(diào)控作用。然后,豬肌衛(wèi)星細胞和脂肪來源干細胞經(jīng)MSTN處理48 h,利用高通量表達譜測序的方法篩選MSTN處理前后差異表達的基因,并對差異表達基因影響細胞成脂分化的作用進行研究。主要研究成果如下：1. MSTN對PPARy和MyoD基因表達量的影響首先用酶消化法分離豬的脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)和肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite cells, MSCs),然后分別通過免疫組化檢測desmin和CD44的表達情況及油紅O染色鑒定細胞的成脂分化能力對細胞進行鑒定,結(jié)果表示：成功分離了豬脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞。脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞經(jīng)濃度為100 ng/mL MSTN分別處理0 h、24 h、48 h,然后檢測PPARγ和MyoD在mRNA水平、蛋白水平及DNA甲基化水平上的表達情況。結(jié)果顯示：在脂肪來源干細胞中,MSTN處理24 h組與0 h組相比,JPARγ和MyoD的表達量沒有顯著性變化,但是MyoD的表達量有上升的趨勢；MSTN處理48 h組與0 h組相比,PPARy的mRNA水平顯著性上升了2.76倍,MyoD的mRNA水平顯著性上升了8.33倍：從0 h至48 h, PPARγ和MyoD的蛋白表達量持續(xù)增加,而啟動子甲基化水平降低。在肌衛(wèi)星細胞中,MSTN處理0 h至48 h的過程中,PPARy和MyoD的mRNA水平持續(xù)下降：與0h相比,24 h和48 h時的PPARy和MyoD的蛋白表達量減少,啟動子甲基化水平上升�？傊�,在脂肪來源干細胞中MSTN促進了PPARy和MyoD的表達,并且與PPARγ相比,MyoD的表達量在mRNA水平上上升的時間較早(24 h)且上升的程度較高(8.332.76)。而在肌衛(wèi)星細胞中MSTN抑制了PPARγ和MyoD的表達。表明,在兩種細胞中MSTN對PPARγ和MyoD表達量的影響不同,進而影響了脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞的成脂分化。2.轉(zhuǎn)錄因子MyoD對PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的影響結(jié)果顯示：在脂肪來源干細胞中超表達MyoD基因顯著性上調(diào)了PPARγ的表達,并且超表達組的脂滴沉積量及脂肪標記基因(aP2和C/EBPα)的mRNA表達量都高于對照組,這表明超表達MyoD增強了細胞的成脂分化能力。而在肌衛(wèi)星細胞中干涉MyoD基因顯著性降低了PPARy的表達,同時細胞的成脂分化能力受到抑制。構(gòu)建5個JPARγ啟動子缺失片段,雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示pGL3-PPARyP3的活性最高。轉(zhuǎn)染MyoD超表達載體(pcDNA-MyoD)顯著提高了缺失片段的熒光值。以野生型pGL3-PPARγP3質(zhì)粒為模板,將預(yù)測的MyoD結(jié)合位點和E-box位點突變后與pcDNA-MyoD共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒相比其熒光活性顯著性降低。EMSA和ChIP-PCR分別從體外、體內(nèi)證明了MyoD可以直接結(jié)合到PARγ啟動子區(qū)。3. MSTN處理豬ADSCs和MSCs后差異表達基因的篩選及功能分析豬脂肪來源干細胞和肌衛(wèi)星細胞的MSTN處理組及各自的對照組于48 h時利用Trizol法提取細胞的總RNA,每組3個生物學(xué)重復(fù)共構(gòu)建12個測序文庫用于高通量表達譜測序。其中規(guī)定AM為脂肪來源干細胞MSTN處理組；AC為脂肪來源干細胞對照組；MM為肌衛(wèi)星細胞MSTN處理組：MC為肌衛(wèi)星細胞對照組。測序結(jié)果顯示：AC與MC相比有257個差異表達基因(116個上調(diào)表達,141個下調(diào)表達)：AM與AC相比有139個差異表達基因(37個上調(diào)表達,102個下調(diào)表達)：AM與MM相比有741個差異表達基因(649個上調(diào)表達,92個下調(diào)表達)；MM與MC相比有1640個差異表達基因(60個上調(diào)表達,1580個下調(diào)表達)。將AM/AC組差異表達基因及MM/MC組差異表達基因經(jīng)GO功能分析和KEGG通路分析,篩選與脂肪發(fā)育相關(guān)且在兩個對比組中有不同的表達模式的差異基因,本研究中選擇了兩個基因(WISP2和KLF6)做后續(xù)的研究。油紅O結(jié)果顯示：超表達WISP2抑制了脂肪來源干細胞的成脂分化,而干涉WISP2則促進了脂肪來源干細胞的成脂分化。超表達KLF6促進了脂肪來源干細胞的成脂分化,而干涉KLF6則抑制了脂肪來源干細胞的成脂分化。結(jié)論：①在脂肪來源干細胞中,MSTN促進MyoD的表達,然后MyoD作為轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到PPARγ的啟動子區(qū)域并且對其轉(zhuǎn)錄活性起到促進作用,PPARγ的表達進而觸發(fā)了細胞的成脂分化；而在肌衛(wèi)星細胞中,MSTN抑制MyoD的表達,MyoD對PPARγ的促進作用中斷,細胞的成脂分化也受到影響。②PPARγ和MyoD的表達受到啟動子甲基化的影響。③WISP2和KLF6在MSTN處理兩種細胞的過程中發(fā)揮著調(diào)控脂肪分化的作用。④肌內(nèi)脂肪細胞主要來源于脂肪來源干細胞。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：1320517