本文關(guān)鍵詞：小麥抗條銹病基因Yr26載體材料BAC文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是世界上第二大糧食作物,全球30%的人口以它為主糧,中國是世界上小麥產(chǎn)量最大的國家。然而小麥的生產(chǎn)一直受到逆境條件的威脅,小麥條銹病作為小麥上最重要的病害之一,在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生,一般年份造成10-70%的產(chǎn)量損失,大發(fā)生時(shí)甚至絕收。中國作為世界上最大的條銹病流行區(qū),年均發(fā)病面積約400萬公頃,歷史上曾有四次全國大流行,每次都造成了100萬噸以上的產(chǎn)量損失。種植抗病品種被認(rèn)為是防治條銹病最為經(jīng)濟(jì)有效的手段,在我國小麥條銹菌的核心越夏區(qū)甘肅隴南,2001-2013年間,流行頻率最高的兩個(gè)小種一直都是CYR32和CYR33,因此,能同時(shí)對(duì)這兩個(gè)小種都具有抗病性的Yr26基因就廣泛應(yīng)用于小麥育種。然而,病原菌通過毒性變異,不斷逃避抗病基因的識(shí)別,進(jìn)而引發(fā)新的流行。比如在2008年第一次檢測(cè)到對(duì)Yr26抗病基因有毒性的V26條銹菌系之后,這一菌系的流行頻率不斷上升,截止到2012年,在隴南地區(qū)的標(biāo)樣檢測(cè)中其流行頻率達(dá)到了16.10%,僅排在CYR32和CYR33的流行頻率之后,這三個(gè)小種的流行頻率總和高達(dá)70%。生產(chǎn)上攜帶有Yr26基因的抗源川麥42、內(nèi)麥8號(hào)、內(nèi)麥9號(hào)、內(nèi)麥10號(hào)、內(nèi)麥11號(hào)以及綿麥37等一系列品種現(xiàn)已變成了這一新菌系的哺育材料,使得小麥條銹病的全國范圍的大流行潛勢(shì)很高,因此一方面通過圖位克隆獲取Yr26基因的序列,并通過Yr26基因與無毒性小種CYR32的互作,揭示專化抗病基因的抗病機(jī)理,對(duì)抗病基因的合理利用及培育持久抗病材料奠定理論基礎(chǔ);另一方面明確哪些抗條銹病基因?qū)δ壳爸饕娜齻�(gè)流行小種還具有利用價(jià)值,以期通過抗病基因的合理布局和開展預(yù)見性抗條銹病育種達(dá)到利用寄主抗病性來防控條銹病的目的。為此,本研究首先構(gòu)建了其載體材料92R137的BAC文庫,為Yr26基因的圖位克隆奠定基礎(chǔ);隨后通過對(duì)Yr26近等基因系接種條銹菌CYR32后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,研究Yr26基因介導(dǎo)的抗病信號(hào)通路,并獲取可用于開發(fā)標(biāo)記的序列信息,為Yr26基因的精細(xì)定位和功能分析奠定基礎(chǔ);最后為了應(yīng)對(duì)當(dāng)前對(duì)Yr26基因有毒性的新小種的出現(xiàn),本研究對(duì)92份攜帶有已知的基因及對(duì)照材料分別接種CYR32、CYR33和V26,并結(jié)合田間調(diào)查,明確在生產(chǎn)中哪些抗病基因就還具有利用價(jià)值;本研究取得了如下研究結(jié)果:1)為了Yr26基因的圖位克隆,用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI構(gòu)建了Yr26基因載體材料92R137基因組DNA的兩個(gè)BAC文庫。HindIII構(gòu)建的文庫包含390,144個(gè)單克隆,經(jīng)過隨機(jī)挑選的453個(gè)單克隆的插入片段檢測(cè),這些克隆的平均插入片段為129kb,覆蓋小麥基因組3.01倍,其中空載率為1.4%。BamHI構(gòu)建的文庫一共挑取了375,552個(gè)克隆,其中隨機(jī)挑取了573個(gè)克隆檢測(cè)插入片段大小,平均插入片段112.6 kb,覆蓋了基因組2.53倍,空載率為3.4%。這兩個(gè)文庫加起來一共包含了765,696個(gè)克隆,存儲(chǔ)于1,994個(gè)384孔板中,對(duì)小麥的基因組覆蓋率為5.54倍。從中隨機(jī)846個(gè)克隆進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)葉綠體污染率為0.71%。使用5-D混池策略,將所有BAC文庫混合為超級(jí)池。為了檢測(cè)所構(gòu)建文庫的可用性,使用Yr26基因的連鎖標(biāo)記Xwe173篩選上述超級(jí)池的DNA,成功獲取了6個(gè)陽性克隆。2)為探索Yr26基因與CYR32的互作機(jī)理,本研究利用高通量的二代測(cè)序技術(shù),對(duì)接種了條銹菌CYR32的Yr26基因的近等基因系小麥葉片進(jìn)行了6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲取了約29億個(gè)reads和365G的clean data。與中國春的參考基因組比對(duì)后,在所有的112496個(gè)基因中,鑒定到了68985個(gè)表達(dá)基因。通過對(duì)接種后同一時(shí)間點(diǎn)下,NIL-R與NIL-S的差異表達(dá)基因分析,一共鑒定到了14449個(gè)顯著差異表達(dá)的基因,重點(diǎn)分析了參與光合作用、激素代謝和防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路的差異基因的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)參與光合作用的基因顯著下調(diào)表達(dá),不同的激素表達(dá)模式差異較大,而防衛(wèi)反應(yīng)基因呈現(xiàn)較強(qiáng)的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。這一研究工作提供了研究小麥與條銹病互作更加全面系統(tǒng)的視角,也為下一步的重點(diǎn)研究工作奠定了基礎(chǔ)。3)由于對(duì)Yr26基因有毒性的新菌系的出現(xiàn),原有的許多抗病品種變成哺育材料,為了充分利用品種抗病性來控制條銹病的流行,本研究利用當(dāng)前流行頻率最高的3個(gè)小種(CYR32、CYR33、V26(菌系編號(hào)平南17-5)),對(duì)92份攜帶已知抗條銹病基因的小麥材料分別進(jìn)行苗期和成株期抗病性鑒定,結(jié)合多年的天水自然病圃的調(diào)查,以評(píng)估各已知Yr基因在中國抗病育種中的有效性,為抗條銹病育種提供理論基礎(chǔ)及育種材料。分析結(jié)果表明,所有供試材料中,只有Yr5、Yr15和Yr61這3個(gè)基因?qū)Ξ?dāng)前流行小種表現(xiàn)為全生育期抗病性;Yr32、YrTr1和YrTye這3個(gè)基因具有成株期抗病性;此外,Mega、Ibis、Hyak、Maris Huntsman、Hobbit、CarstensV、Express、Lee和Compair等9份含多個(gè)Yr基因組合的材料表現(xiàn)出良好的成株期抗條銹性,這些抗病基因均可應(yīng)用于當(dāng)前的抗病育種中。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.121.42

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本文編號(hào)：1320688