本文關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌蛋白激酶Prp4調(diào)控mRNA剪切機(jī)制研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：前體mRNA剪切是真核生物中十分重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制;前體mRNA剪切的有序進(jìn)行受到剪接復(fù)合體的調(diào)控,剪接復(fù)合體是由U1、U2、U4、U6和U5五種核小核糖復(fù)合體以及大量的非核糖核蛋白剪切因子組成的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的復(fù)合結(jié)構(gòu)�？赡媪姿峄磻�(yīng)影響真核生物的大多數(shù)細(xì)胞活性,其中就包括前體mRNA的剪切過(guò)程;同時(shí)剪接相關(guān)蛋白的磷酸化在剪切進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在所有的剪接體組成成分中,Prp4是其中唯一的蛋白激酶。盡管Prp4是裂殖酵母和其他真核生物生命活動(dòng)所必須的蛋白激酶,但是在啤酒酵母中只有少量的長(zhǎng)度較小的內(nèi)含子并且缺少Prp4蛋白激酶的直接同源蛋白,同時(shí)在引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌中PRP4基因缺失突變體依然能夠存活。禾谷鐮刀菌中Prp4蛋白激酶不但具有一個(gè)保守的C端激酶結(jié)構(gòu)域還具有一個(gè)額外的富含絲氨酸和精氨酸的N端亞結(jié)構(gòu)域。對(duì)Prp4N端富含絲氨酸和精氨酸的310個(gè)氨基酸區(qū)域的敲除分析顯示,這一部分對(duì)Prp4蛋白激酶的定位和功能起到重要的作用。對(duì)Prp4蛋白激酶的磷酸化組分析發(fā)現(xiàn)在這段N端區(qū)域含有一個(gè)能夠被磷酸化的位點(diǎn)S289,這個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)Prp4正常行使功能具有重要作用。通過(guò)對(duì)我們的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Prp4蛋白激酶并不是前體mRNA的內(nèi)含子剪切所必須的蛋白因子,但是Prp4蛋白激酶在調(diào)控內(nèi)含子剪切效率上發(fā)揮重要的作用;同時(shí)與剪切效率不受Prp4調(diào)控的內(nèi)含子相比,Prp4蛋白激酶依賴(lài)的內(nèi)含子在5’剪切位點(diǎn)與分支位點(diǎn)的距離上表現(xiàn)出長(zhǎng)度更長(zhǎng)的趨勢(shì)。PRP4缺失突變體雖然能夠存活但是表現(xiàn)出多種表型缺陷,并且能夠產(chǎn)生恢復(fù)生長(zhǎng)速率的自發(fā)抑制突變形成自發(fā)抑制子。超過(guò)300個(gè)生長(zhǎng)速率恢復(fù)或者部分恢復(fù)的自發(fā)突變抑制子被分離得到,并且對(duì)其中的49個(gè)角變子進(jìn)行了分生孢子產(chǎn)生量、有性生殖和致病性等方面的表型測(cè)定發(fā)現(xiàn):49個(gè)角變子中沒(méi)有一個(gè)能夠完全恢復(fù)PRP4缺失突變體造成的缺陷。對(duì)角變子S2和S47進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)角變子只能部分恢復(fù)內(nèi)含子的剪切效率。這些結(jié)果意味著所有角變子都不能完全恢復(fù)內(nèi)含子的剪切效率。通過(guò)對(duì)三聯(lián)體候選基因的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),在PRP6、PRP31、BRR2和PRP8基因上能夠鑒定到抑制突變的發(fā)生。在BRR2和PRP8上的兩個(gè)抑制突變與從啤酒酵母或者是裂殖酵母中同源基因鑒定的突變變位點(diǎn)一致。而PRP6和PRP31中的突變位點(diǎn)還沒(méi)有被報(bào)道。因?yàn)镻rp31是三聯(lián)體組成蛋白中前體mRNA剪切所必需的剪切因子;同時(shí)Prp31發(fā)生在R464位的無(wú)義突變?cè)斐闪薈端130個(gè)氨基酸區(qū)域的缺失,而這段區(qū)域中包含所有預(yù)測(cè)的在禾谷鐮刀菌中十分保守的Prp4對(duì)Prp31的磷酸化位點(diǎn),所以我們選擇Prp31進(jìn)行深入的研究。在本研究中通過(guò)對(duì)260個(gè)抑制角變子進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在28個(gè)角變子的PRP31基因的C端尾巴上鑒定到抑制突變位點(diǎn)。我們通過(guò)酵母雙雜交和免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn),Prp31的C段區(qū)域能夠與Prp31的N端區(qū)域發(fā)生相互作用而結(jié)合從而對(duì)Prp31的功能起到自抑制的作用。Prp31中起到抑制PRP4缺失造成缺陷的無(wú)義突變或者點(diǎn)突變都能夠減弱Prp31與Prp6之間的相互作用,同時(shí)增強(qiáng)Prp31與Brr2之間的互作。我們進(jìn)一步分析確定了禾谷鐮刀菌中Prp31能夠被Prp4蛋白激酶所磷酸化,進(jìn)而對(duì)Prp31預(yù)測(cè)的保守磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變分析發(fā)現(xiàn),Prp31中多個(gè)預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)突變能夠抑制PRP4缺失造成的表型缺陷,最后鑒定的S520、S521和T525三個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)Prp31的功能具有重要作用。Prp4對(duì)Prp31的磷酸化作用能夠釋放Prp31自身的自抑制結(jié)合,并影響Prp31與Brr2以及其他三聯(lián)體組成蛋白之間的互作進(jìn)而影響復(fù)合體B的激活。綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Prp4雖然不是前體mRNA剪切所必須的剪切因子,但是在調(diào)控內(nèi)含子剪切效率上發(fā)揮著重要作用,并且Prp4通過(guò)對(duì)Prp31的磷酸化作用來(lái)調(diào)控剪切效率以及U4/U6-U5三聯(lián)體之間的相互作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S435.121.45

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本文編號(hào)：1310606