本文關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌蛋白激酶Prp4調(diào)控mRNA剪切機制研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：前體mRNA剪切是真核生物中十分重要的基因表達調(diào)控機制;前體mRNA剪切的有序進行受到剪接復(fù)合體的調(diào)控,剪接復(fù)合體是由U1、U2、U4、U6和U5五種核小核糖復(fù)合體以及大量的非核糖核蛋白剪切因子組成的復(fù)雜的動態(tài)的復(fù)合結(jié)構(gòu)�？赡媪姿峄磻�(yīng)影響真核生物的大多數(shù)細胞活性,其中就包括前體mRNA的剪切過程;同時剪接相關(guān)蛋白的磷酸化在剪切進程中發(fā)揮重要作用。在所有的剪接體組成成分中,Prp4是其中唯一的蛋白激酶。盡管Prp4是裂殖酵母和其他真核生物生命活動所必須的蛋白激酶,但是在啤酒酵母中只有少量的長度較小的內(nèi)含子并且缺少Prp4蛋白激酶的直接同源蛋白,同時在引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌中PRP4基因缺失突變體依然能夠存活。禾谷鐮刀菌中Prp4蛋白激酶不但具有一個保守的C端激酶結(jié)構(gòu)域還具有一個額外的富含絲氨酸和精氨酸的N端亞結(jié)構(gòu)域。對Prp4N端富含絲氨酸和精氨酸的310個氨基酸區(qū)域的敲除分析顯示,這一部分對Prp4蛋白激酶的定位和功能起到重要的作用。對Prp4蛋白激酶的磷酸化組分析發(fā)現(xiàn)在這段N端區(qū)域含有一個能夠被磷酸化的位點S289,這個磷酸化位點對Prp4正常行使功能具有重要作用。通過對我們的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),Prp4蛋白激酶并不是前體mRNA的內(nèi)含子剪切所必須的蛋白因子,但是Prp4蛋白激酶在調(diào)控內(nèi)含子剪切效率上發(fā)揮重要的作用;同時與剪切效率不受Prp4調(diào)控的內(nèi)含子相比,Prp4蛋白激酶依賴的內(nèi)含子在5’剪切位點與分支位點的距離上表現(xiàn)出長度更長的趨勢。PRP4缺失突變體雖然能夠存活但是表現(xiàn)出多種表型缺陷,并且能夠產(chǎn)生恢復(fù)生長速率的自發(fā)抑制突變形成自發(fā)抑制子。超過300個生長速率恢復(fù)或者部分恢復(fù)的自發(fā)突變抑制子被分離得到,并且對其中的49個角變子進行了分生孢子產(chǎn)生量、有性生殖和致病性等方面的表型測定發(fā)現(xiàn):49個角變子中沒有一個能夠完全恢復(fù)PRP4缺失突變體造成的缺陷。對角變子S2和S47進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)角變子只能部分恢復(fù)內(nèi)含子的剪切效率。這些結(jié)果意味著所有角變子都不能完全恢復(fù)內(nèi)含子的剪切效率。通過對三聯(lián)體候選基因的測序分析發(fā)現(xiàn),在PRP6、PRP31、BRR2和PRP8基因上能夠鑒定到抑制突變的發(fā)生。在BRR2和PRP8上的兩個抑制突變與從啤酒酵母或者是裂殖酵母中同源基因鑒定的突變變位點一致。而PRP6和PRP31中的突變位點還沒有被報道。因為Prp31是三聯(lián)體組成蛋白中前體mRNA剪切所必需的剪切因子;同時Prp31發(fā)生在R464位的無義突變造成了C端130個氨基酸區(qū)域的缺失,而這段區(qū)域中包含所有預(yù)測的在禾谷鐮刀菌中十分保守的Prp4對Prp31的磷酸化位點,所以我們選擇Prp31進行深入的研究。在本研究中通過對260個抑制角變子進行測序,發(fā)現(xiàn)在28個角變子的PRP31基因的C端尾巴上鑒定到抑制突變位點。我們通過酵母雙雜交和免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn),Prp31的C段區(qū)域能夠與Prp31的N端區(qū)域發(fā)生相互作用而結(jié)合從而對Prp31的功能起到自抑制的作用。Prp31中起到抑制PRP4缺失造成缺陷的無義突變或者點突變都能夠減弱Prp31與Prp6之間的相互作用,同時增強Prp31與Brr2之間的互作。我們進一步分析確定了禾谷鐮刀菌中Prp31能夠被Prp4蛋白激酶所磷酸化,進而對Prp31預(yù)測的保守磷酸化位點進行突變分析發(fā)現(xiàn),Prp31中多個預(yù)測的磷酸化位點突變能夠抑制PRP4缺失造成的表型缺陷,最后鑒定的S520、S521和T525三個磷酸化位點對Prp31的功能具有重要作用。Prp4對Prp31的磷酸化作用能夠釋放Prp31自身的自抑制結(jié)合,并影響Prp31與Brr2以及其他三聯(lián)體組成蛋白之間的互作進而影響復(fù)合體B的激活。綜上所述,我們的實驗結(jié)果說明Prp4雖然不是前體mRNA剪切所必須的剪切因子,但是在調(diào)控內(nèi)含子剪切效率上發(fā)揮著重要作用,并且Prp4通過對Prp31的磷酸化作用來調(diào)控剪切效率以及U4/U6-U5三聯(lián)體之間的相互作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.121.45

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