發(fā)布時(shí)間：2017-12-20 04:09

  本文關(guān)鍵詞：綿羊血矛線蟲感染致皺胃微生物群落、血矛線蟲微生物群落及皺胃基因表達(dá)譜變化的病理生理學(xué)分析　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是寄生于牛、羊等反會(huì)動(dòng)物消化道的一種重要的寄生蟲,可引起感染動(dòng)物貧血、消瘦甚至死亡,給畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,對(duì)羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控主要依賴于抗蟲藥物。然而,該類藥物的頻繁使用導(dǎo)致產(chǎn)生了耐藥性蟲株,而逐漸被限制使用。再加上,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的疫苗并不能像細(xì)菌或病毒疫苗那樣產(chǎn)生無(wú)菌免疫力。因此,很好的了解宿主與寄生蟲之間的相互作用有助于對(duì)該病制定有效防控策略及生產(chǎn)管理規(guī)范。除此之外,還有很多制約開(kāi)展該類研究的因素需要我們解決。比如,尚無(wú)合適的方法防止DNA或RNA在提取過(guò)程中降解;尚無(wú)在最短的時(shí)間內(nèi)大規(guī)模從糞便中收集和純化卵囊或蟲卵的方法。目前已報(bào)道的大多數(shù)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解決這些瓶頸。本研究目的是探索宿主與寄生蟲之間的菌群種類及利用體內(nèi)或間接體內(nèi)系統(tǒng)揭示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在感染過(guò)程中蟲體分子生物學(xué)特性。特別強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是,我們對(duì)蟲卵的提取和純化、核酸的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。就傳統(tǒng)的DNA或RNA提取方法而言,我們發(fā)現(xiàn)在裂解過(guò)程中核苷酸受到三重保護(hù)(如EDTA,SDS和NaCl),這個(gè)環(huán)境并不適宜RNase或DNase發(fā)揮作用。因此,完全去除RNA就要在DNA提完以后再加入RNase。同樣,提完RNA后加入DNase去除DNA污染。另外,我們利用電奶油分離器和真空過(guò)濾裝置收集和純化艾美耳球蟲卵囊和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲卵,其回收效率分別高達(dá)81%和92%,孢子化率(存活率)分別是68%和74%。處理12升糞便懸液只需要7.5分鐘。我們檢測(cè)了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在早期和晚期感染過(guò)程中對(duì)皺胃和瘤胃菌群及宿主的影響。分離羊皺胃組織用于組織學(xué)和解剖學(xué)分析,并檢測(cè)胃液的PH值。微生物菌群用于16SrRNA測(cè)序。結(jié)果表明,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染增加皺胃胃液的PH值(P=0.04953),引起前盲囊乳突數(shù)量大量增加(P=0.0463),并導(dǎo)致壞死和炎癥變化在急性感染階段更加嚴(yán)重。羊感染H.contortus7天,皺胃和瘤胃菌群分別有98%和94%的細(xì)菌發(fā)生顯著變化(P = 0.0369-0.0495)。然而,感染50天以后,菌群變化分別是 62%和69%(P = 0.0369-0.0495)。本研究利用Illumina MiSeq平臺(tái)探索H.contortus在不同生活史階段菌群的變化,擴(kuò)增區(qū)域是V3-V4,和V5-V7區(qū)。V3-V4測(cè)序結(jié)果表明,H contortus菌群包括48個(gè)屬,而V5-V7測(cè)序結(jié)果有 28 個(gè)屬。優(yōu)勢(shì)菌分別是Escherichia-Shigella,Pseudomonas and Ochrobctrum,存在于線蟲生活史的所有階段。羊皺胃組織采自H.contortus感染后7天和50天,用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序�；贗lluminaHi Seq 4000平臺(tái)的測(cè)序結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,感染組在第7天有548個(gè)基因上調(diào)表達(dá),有301個(gè)基因下調(diào)表達(dá),50天感染組與7天感染組相比,有357個(gè)基因上調(diào)表達(dá),355個(gè)基因下調(diào),與對(duì)照組相比只有7個(gè)基因上調(diào)表達(dá),11個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。該結(jié)果表明,H.contortus.在感染早期與晚期相比更有效地激活皺胃基因的表達(dá)。為了研究H.contortus幼蟲階段入侵羊粘膜激發(fā)的直接免疫應(yīng)答,我們建立了一個(gè)間接體內(nèi)胃底粘膜模型來(lái)模仿體內(nèi)不同細(xì)胞間的作用過(guò)程,來(lái)探索捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染早期基因表達(dá)情況。分離羊皺胃用于組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,上清液用于測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的活性。免疫應(yīng)答關(guān)鍵基因包括 IL-6,IL-8,C1q,CXCR-3,CXCL-2,超氧化物岐化酶,ITGA7/8/9,ITGB1,ITGB6,ICAM-1和Actin1表達(dá)水平發(fā)生變化。綜之,上述結(jié)果表明,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染對(duì)胃菌群的組成、多樣性起到重要作用,線蟲體內(nèi)的菌群也反映了外部的微生物。此外,galectins可以被看作是宿主在H.contortus不同感染階段發(fā)揮免疫調(diào)控作用的分子。本研究完全拓展了我們對(duì)宿主羊和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的微生物群的理解,及H.contortus感染即時(shí)期、早期和晚期羊胃基因表達(dá)情況,并改進(jìn)了一些寄生蟲學(xué)研究方面的技術(shù),如卵的收集與純化,核苷酸提取,這對(duì)后期研究提供重要的應(yīng)用價(jià)值。此外,H.contortus誘導(dǎo)劑可引起防御相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá),并引發(fā)炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答。本研究展示了已經(jīng)取得的研究成果,以期為胃腸道寄生蟲的防控提供應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.26

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Nilusha Malmuthuge;Le Luo Guan;;Understanding host-microbial interactions in rumen:searching the best opportunity for microbiota manipulation[J];Journal of Animal Science and Biotechnology;2017年02期

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本文編號(hào)：1310685