本文關(guān)鍵詞：綿羊精子凍融損傷與精子蛋白質(zhì)標(biāo)志物的相關(guān)性研究

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【摘要】：滲透壓和溫度在凍融過程中的改變,影響精子的形態(tài)和功能,使精子質(zhì)膜流動(dòng)性、滲透性、脂質(zhì)組成以及線粒體活性等發(fā)生改變。精子對(duì)氧化性脅迫敏感性很強(qiáng),超低溫冷凍對(duì)精子的頭部、質(zhì)膜、頂體、尾部以及精核都會(huì)產(chǎn)生損傷,使精子活動(dòng)力和活率減弱,影響受精和早期胚胎發(fā)育等事件,這些結(jié)果與精子蛋白質(zhì)的缺失或減少有關(guān)。目前,尚無(wú)有關(guān)綿羊精子凍融損傷的明確機(jī)制的報(bào)道,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的興起與普及,為從蛋白質(zhì)層面揭示綿羊精子凍融損傷機(jī)制提供了契機(jī)。本研究以綿羊鮮精和凍融精子為實(shí)驗(yàn)材料,利用二維電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白質(zhì),通過構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵標(biāo)志蛋白,然后利用免疫印跡、免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)狀況,最后分析目的蛋白與綿羊精子凍融損傷的相關(guān)性。研究旨在通過篩選精子凍融損傷的蛋白標(biāo)志物揭示綿羊精子的凍融損傷機(jī)制,為冷凍保護(hù)劑的研究提供候選分子靶標(biāo)。結(jié)果顯示:(1)凍融過程會(huì)顯著降低綿羊精子活率、活動(dòng)率、ATP含量、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和線粒體功能,增加精子DNA損傷和ROS含量,降低綿羊精子質(zhì)量。(2)利用PDQuest8.0軟件分析2-DE凝膠,將差異表達(dá)倍數(shù)設(shè)定為≥2,共得到25個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn),在凍融精子凝膠上豐度減少的有17個(gè),豐度增加的有8個(gè)。差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定,在國(guó)際生物信息學(xué)中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)搜索到相對(duì)應(yīng)的21種蛋白質(zhì)。利用GO注釋和KEGG富集對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行基因功能注釋和通路富集,表明凍融過程會(huì)引起綿羊精子蛋白質(zhì)組整體水平的改變,差異蛋白涉及多種生物學(xué)過程。(3)通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),CK2(CK2α和CK2α’)可能參與凍融精子凋亡;HK1參與糖酵解過程,與凍融精子的能量供給有關(guān);CK2和HK1可能是潛在的綿羊精子凍融損傷標(biāo)志物。(4)利用Western blotting驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CK2α、CK2α’和HK1蛋白在綿羊凍融精子含量降低。免疫熒光定位顯示,CK2α主要分布在精子中段,CK2α’主要分布在精子頂體,HK1主要分布在精子頭部和中段。(5)CK2α’蛋白含量在凍融精液的精漿中增加,HK1蛋白含量在凍融精液的精漿沒有變化,說(shuō)明凍融過程會(huì)使CK2α’蛋白外流到精漿,而HK1蛋白會(huì)在精子內(nèi)部降解。(6)CK2α’和HK1 mRNA含量在凍融精子減少,說(shuō)明凍融過程會(huì)使CK2α’和HK1 mRNA發(fā)生降解。(7)通過SPSS相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),與鮮精相比,凍融精子的頂體完整率與CK2α’蛋白含量成正相關(guān),凍融精子的DNA損傷率與CK2α’蛋白含量成負(fù)相關(guān);凍融精子的凋亡率與CK2α蛋白含量成負(fù)相關(guān);凍融精子的活動(dòng)率與HK1蛋白含量成正相關(guān),凍融精子的ATP含量與HK1蛋白含量成正相關(guān)。說(shuō)明CK2和HK1蛋白能作為綿羊精子凍傷的蛋白標(biāo)志物。研究表明:利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選綿羊精子凍傷的蛋白標(biāo)志物是可行的,通過蛋白質(zhì)表達(dá)譜的構(gòu)建,能夠獲得較為全面可靠的差異蛋白信息。通過蛋白質(zhì)互作分析,能夠篩選出綿羊精子凍融損傷的標(biāo)志蛋白,通過驗(yàn)證標(biāo)志蛋白的含量和分布,并與綿羊凍融精子質(zhì)量參數(shù)作對(duì)比,能夠得到標(biāo)志蛋白與凍融精子質(zhì)量的相關(guān)性。對(duì)潛在的綿羊精子凍融損傷標(biāo)志蛋白的研究,有利于揭示綿羊精子凍融損傷的內(nèi)在分子機(jī)制,有針對(duì)性的開展綿羊精子冷凍保護(hù)劑研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S826

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本文編號(hào)：1302402