本文關鍵詞：玉米與其近緣種屬間多倍體雜種的合成和遺傳學研究

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【摘要】：植物種屬間的雜交和多倍化是高等植物形成和進化的重要驅動力。多倍化導致核基因組的聚變,常會帶來新的性狀變異,使其更適合育種選擇和自身發(fā)展需要。自然界中多倍體分布廣泛,但較長時間的進化歷程以及模糊的親緣關系,限制了對其進一步的研究應用。人工合成的多倍體因親緣關系明晰和較短的進化歷程而備受關注。玉米近緣野生材料大芻草和摩擦禾是自然保留下來的重要遺傳材料,通過雜交和多倍化等途徑創(chuàng)造新的種質資源,并對合成的多倍體雜種的遺傳學規(guī)律進行探討,將對玉米遺傳改良和多倍體合成具有重要的理論和實踐意義。本研究在遠緣雜交和加倍合成系列玉米、大芻草和摩擦禾多倍體雜種的基礎上,利用解剖學、細胞遺傳學、分子生物學等技術,分析不同親本基因組組成、不同細胞質組成以及不同倍性對合成的多倍體表型、染色體、基因組、序列以及后代染色體的組成的影響。研究結果如下：1以玉米(MM20(M),2n=20).四倍體多年生大芻草(9475(P),2n=40)和四倍體指狀摩擦禾(TZ07(T),2n=72)為親本合成了系列兩物種或三物種間的多倍體材料。即MM20同源加倍產生的同源四倍體(MM40),染色體組成為2n=40M;MM20與MM40雜交產生的同源三倍體(MM30),染色體組成為2n=30M;MM20與9475正反交產生的異源三倍體(MP30和PM30),染色體組成為2n=10M+20P;MM40與9475正反交產生的異源四倍體(MP40和PM40),染色體組成為2n=20M+20P;玉米、9475和摩擦禾雜交產生的異源六倍體MTP74(MMTTPP),染色體組成為2n=20M+20P+34T；MTP74與9475回交產生的異源八倍體MTP94(MMTTPPPP),染色體組成為2n=20M+40P+34T.分析表明,同源三倍體、同源四倍體以及異源四倍體的染色體條數(shù)在不同的個體中產生波動；高倍性的MTP74和MTP94是通過遠緣雜交結合2n+n有性生殖加倍的方式形成的異源多倍體,兩個異源多倍體營養(yǎng)生長旺盛,多年生,可以通過無性繁殖擴繁,二者的染色體條數(shù)并未隨著擴繁和種植年限增加而改變。2通過形態(tài)解剖和顯微測量技術,對合成的多倍體的氣孔、花粉和細胞核以及DNA含量進行比較分析。結果表明,氣孔大小隨著倍性的增加而增大,具有“多倍化效應”,并且受遠緣雜交和不同細胞質組成的影響。然而,花粉粒和細胞核的大小與遠緣雜交、倍性以及不同細胞質組成的相關性較小。DNA含量的增加與倍性有關,但是DNA含量的丟失主要受遠緣雜交、倍性和不同細胞質的綜合影響。氣孔、花粉、細胞核、DNA含量以及多倍體親本染色體數(shù)的相關性分析表明,氣孔的大小與三親本染色體的多少呈顯著正相關,細胞核的大小與摩擦禾染色體的多少呈顯著正相關�；ǚ坌誀钆cDNA含量無關,但花粉面積和花粉體積與玉米染色體數(shù)呈顯著正相關,花粉長,花粉寬和花粉面積與摩擦禾染色體數(shù)呈顯著負相關。3為了更好的對多倍體三親本染色體組成結構以及后續(xù)的多倍體有絲分裂和減數(shù)分裂染色體行為進行研究,采用基因組原位雜交(GISH)和熒光原位雜交(FISH)相結合對三親本染色體同源性進行了比較分析。結果表明,玉米與9475染色體基因組相互雜交能夠產生較強信號,二者的同源性較高;玉米與摩擦禾基因組相互雜交僅在異染色質紐(Knob)區(qū)域產生信號,具有同源性,二者的能夠在該區(qū)域相互雜交：9475與摩擦禾同樣在Knob區(qū)域具有同源性,但二者基因組的相互雜交中,僅在摩擦禾DNA雜交9475的染色體上產生Knob信號,9475DNA雜交摩擦禾染色體上并沒有檢測出Knob言號。綜合表明,三親本中摩擦禾是較原始的種,與玉米和9475染色體僅在染色體末端Knob區(qū)域具有同源性,親緣關系較遠；玉米和9475同屬,親緣關系較近。4采用雙色GISH對異源四倍體MP40和異源多倍體MTP74有絲分裂各時期的染色體行為和分布進行研究。結果表明,二者有絲分裂過程穩(wěn)定,在各時期并無染色體滯后,染色體橋或染色體不均衡分離等異常染色體的情況出現(xiàn),三親本染色體也沒有在有絲分裂過程中產生獨立區(qū)域,而是彼此交融在一起。5采用品紅染色法和雙色GISH對親本及其合成的系列多倍體減數(shù)分裂行為和穩(wěn)定性進行分析。研究表明,玉米和9475基因組內的A和B亞基因組部分染色體存在同源性,并且在9475細胞中B1和B2亞基因組同樣存在一定的同源性,其染色體的基數(shù)為5。摩擦禾的染色體組成可能與9475類似,為XXX'X'Y1Y1Y2Y2,并且染色體基數(shù)可能為9。對多倍體的價體分析表明,玉米與9475組成的雜合價體數(shù)量最高,并且玉米A亞基因組中有10條染色體可能與9475A亞基因組中的20條染色體具有同源性；在MTP74和MTP94中存在少量摩擦禾與玉米和9475的雜合價體,表明它們之間存在部分的同源性。對多倍體減數(shù)分裂染色體紊亂與育性相關分析表明,多倍體的減數(shù)分裂紊亂程度與育性并無相關性；對多倍體減數(shù)分裂受到的影響因素分析表明,多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性受倍性、外緣親本加入和不同細胞質組成的影響。對同源多倍體和異源多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性比較表明,同源多倍體減數(shù)分裂的穩(wěn)定性低于異源多倍體,緣于玉米異源多倍體中親本部分染色體有限的同源性。對異源多倍體中不同親本的減數(shù)分裂穩(wěn)定性分析表明,玉米的減數(shù)分裂穩(wěn)定性在所有的多倍體中均低于9475；在三物種多倍體MTP74和MTP94中,摩擦禾染色體穩(wěn)定性最高；說明摩擦禾染色體與其他兩個親本的親緣關系較遠,而保持自身染色體的穩(wěn)定性。6利用擴增片段長度多態(tài)性AFLP技術對合成的多倍體以及它們的親本共計9份材料進行多倍體合成早期基因組變化的分析。篩選的16對AFLP引物中共擴增出635條清晰條帶。三親本條帶分析表明,三親本既有特異的條帶,同時具有共同條帶,其中摩擦禾的特異條帶最多,為102個,9475最少,為32個。玉米與9475共有條帶為164個,玉米與摩擦禾共有條帶為64個,9475與摩擦禾共有條帶為32個。三親本共有條帶為154個。對三親本進行聚類分析表明,玉米在基因組一級結構上與9475同源性最高,而摩擦禾在基因組一級結構上與9475的同源性最高,結果與系統(tǒng)分類相符。對多倍體的AFLP條帶分析表明,多倍體對親本條帶以繼承為主,但是所有的多倍體中均產生丟失條帶,條帶的丟失與倍性的增加關系較少,而與基因組內親本的同源性高低有關。對多倍體丟失的條帶分為特異條帶和共有條帶分析表明,多倍體基因組中傾向丟失特異條帶；將丟失的條帶分為不同親本類型分析表明,多倍體基因組中傾向丟失玉米類型的條帶。7利用特定序列單克隆測序技術和熒光原位雜交(FISH)定位分析技術對多倍體序列的演化進行研究。利用FISH技術,以標記的centc序列、45SrDNA序列和5SrDNA序列作探針,研究了多倍體和親本的根尖體細胞中期染色體雜交信號的分布特點。研究結果表明,多倍體著絲粒上的centc序列隨著倍性的增加和外緣親本的加入而改變,主要體現(xiàn)在部分染色體centc信號的降低；而45S和5S序列在染色體上的位置和個數(shù)并沒有發(fā)生明顯的改變。選取存在于45S中的ITS序列對多倍體ITS序列變異分析表明,多倍體中隸屬于不同親本的ITS序列長度和GC含量的改變較小,ITS序列的變異主要體現(xiàn)為位點的變異,位點變異在三親本中均發(fā)生,并受到遠緣雜交、倍性以及細胞質的多重影響。多倍體中ITS序列的變異具有親本的傾向性,其中9475親本類型的ITS序列產生的變異位點最多。多倍體ITS序列的信息位點分析表明,ITS信息位點在多倍體中發(fā)生協(xié)同進化,協(xié)同進化主要發(fā)生在玉米和9475ITS信息位點中,進化程度受多倍體細胞核中親本基因組組成、細胞質、倍性和遠緣雜交的影響；摩擦禾ITS序列在MTP74和MTP94中所占比例較小,其本身ITS序列信息位點并沒有受到其他兩個親本的影響,但摩擦禾ITS序列能夠對其他兩個親本的ITS序列產生影響。8以MTP74和MTP94為母本、9475為父本進行回交,獲得了兩個回交群體,采用雙色GISH的方法,對兩個回交群體植株的染色體數(shù)目、組成等進行比較分析。結果表明,MTP74與9475回交獲得21個回交后代植株,后代群體的染色體數(shù)目在37-82之間,呈現(xiàn)三種不同的生殖方式,分別為單倍體生殖n,正常生殖n+n和無融合生殖2n+n；其中,單倍體生殖n和無融合生殖2n+n各一例,其余19個為n+n方式；n+n方式產生的回交后代中含玉米、9475和摩擦禾的染色體數(shù)目范圍分別為7-13條,26-33條和4-20條,平均數(shù)分別為10.32條、29.42條和16.32條。MTP94與9475回交獲得19個回交后代,后代群體的染色體范圍在47-87之間,呈現(xiàn)三種不同的生殖方式,分別為單倍體生殖n,正常生殖n+n和雙受精n+n+n；其中,單倍體生殖n和雙受精n+n+n各一例,其余17個為n+n方式;n+n方式產生的回交后代中含玉米、9475和摩擦禾的染色體數(shù)目范圍分別為8-16條,30-41條和14-18條,平均數(shù)分別為11.11條、37.94條和16.24條。對兩個群體中不同個體親本染色體數(shù)的變異程度分析表明,兩個群體種玉米染色體數(shù)的變異程度最大。二者間比較表明,MTP94群體僅有摩擦禾染色體數(shù)的變異程度小于MTP74群體,其它他均大于MTP74群體。對兩個群體的染色體結構變異分析表明,兩個回交群體中均出現(xiàn)染色體易位現(xiàn)象,其中MTP74群體和MTP94的易位頻率分別為2.63%和1.720%,易位主要發(fā)生在玉米和9475染色體之間,摩擦禾與兩個親本染色體之間的易位較少。對多倍體減數(shù)分裂和后代染色體組成相關性分析表明,多倍體減數(shù)分裂中親本染色體紊亂系數(shù)與回交后代親本染色體組成的變異程度呈極顯著正相關,多倍體減數(shù)分裂中玉米和9475染色體的異源聯(lián)合與后代玉米和9475染色體的易位呈極顯著正相關。
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S513

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本文編號：1302087