本文關(guān)鍵詞：辣椒抗疫病基因的定位及相關(guān)基因的克隆與功能分析

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【摘要】：辣椒疫病(Phytophthora blight)是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一種威脅辣椒生產(chǎn)的土傳病害。目前,該病害在世界各地的辣椒產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。尋找抗病基因,并育成抗病品種是防治辣椒疫病最理想的方法。關(guān)于辣椒對(duì)疫病的抗性研究一直是眾多科研工作者聚焦的重點(diǎn),但遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),不同抗源材料的抗性遺傳規(guī)律不同,而且所用疫霉菌小種不同,得出的遺傳分析結(jié)果也存在差異。本研究選用了抗性遺傳相對(duì)簡(jiǎn)單的辣椒材料PI201234以及致病力中等的疫霉菌生理小種2。通過遺傳分析、基因定位及VIGS方法,以期定位抗疫病基因,并對(duì)候選基因進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證,為后續(xù)克隆抗病基因,揭示抗病機(jī)制,最終培育抗病品種提供科學(xué)依據(jù)。本研究對(duì)辣椒抗疫病材料PI201234的根部進(jìn)行接種疫霉菌生理小種2和接水處理,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)根部樣品進(jìn)行測(cè)序分析,共篩選到1220個(gè)差異表達(dá)基因,其中有480個(gè)基因顯著上調(diào),740個(gè)基因顯著下調(diào)。根據(jù)基因的功能注釋,找到204個(gè)可能與抗性相關(guān)的基因。從中挑選了12個(gè)具有不同功能的基因,利用熒光定量PCR的方法,分析了它們?cè)诮泳蟛煌瑫r(shí)間的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)模式在抗感材料間有明顯差異,推測(cè)這些基因可能與辣椒對(duì)疫病的抗性有關(guān)。本研究還開發(fā)了SSR標(biāo)記,用于后續(xù)的基因定位和其他遺傳分析。為了定位抗病基因,本研究以抗病材料PI201234和感病材料上海園為親本,構(gòu)建了F2分離群體。利用灌根接種法對(duì)794個(gè)F2單株進(jìn)行抗病性鑒定,發(fā)現(xiàn)抗感單株的分離比符合3：1,表明PI201234對(duì)疫霉菌生理小種2的抗性是受單顯性基因控制的,將該基因暫時(shí)命名為CaPhyto。通過基因定位,最終將CaPhyto定位在了辣椒5號(hào)染色體1.08 Mb的區(qū)域內(nèi)。參照Z(yǔ)unla-1基因組注釋信息,發(fā)現(xiàn)在這個(gè)區(qū)域內(nèi)有11個(gè)基因,其中5個(gè)基因具有抗病相關(guān)的功能注釋。定位結(jié)果顯示,標(biāo)記ZL6726與ZL6970與抗病基因緊密連鎖。通過實(shí)際應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)標(biāo)記ZL6726的準(zhǔn)確性較高,達(dá)到97.1%,適用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。利用VIGS的方法,對(duì)候選基因的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證。沉默后的抗性鑒定結(jié)果顯示,只有基因Capana05g000764被沉默后的部分植株出現(xiàn)了感病的表型,因此推測(cè)該基因與PI201234對(duì)疫病的抗性有關(guān)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析及聚類分析結(jié)果表明,該基因是一個(gè)油菜素內(nèi)酯甾醇類化合物的受體蛋白類家族基因BRL2,但前人研究認(rèn)為,BRL2并不能編碼油菜素內(nèi)酯甾醇類化合物受體蛋白,而是調(diào)節(jié)原形成層細(xì)胞的早期分化。表達(dá)分析結(jié)果顯示,基因Capana05g000764在根部表達(dá)量最高,且在PI201234接菌后上調(diào)表達(dá),但在上海園中下調(diào)表達(dá)。結(jié)合植株的發(fā)病癥狀,推測(cè)該基因參與了植物對(duì)疫霉菌的抗性。該基因的功能還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過對(duì)抗疫病材料PI201234進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,找到了204個(gè)抗疫病相關(guān)基因,并開發(fā)了4723對(duì)SSR標(biāo)記；通過基因定位,將抗病基因定位在了辣椒5號(hào)染色體1.08 Mb的物理范圍內(nèi)；通過VIGS功能初步分析,找到了與抗病相關(guān)的候選基因Capana05g000764,并對(duì)候選基因的功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。本研究所得數(shù)據(jù)及結(jié)論為后續(xù)克隆抗病基因并進(jìn)行功能互補(bǔ)驗(yàn)證做了準(zhǔn)備,所開發(fā)分子標(biāo)記ZL6726可為辣椒抗疫病育種提供方便。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.418.1

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本文編號(hào)：1297994