本文關鍵詞：雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原細菌鐵蛋白誘導產(chǎn)生IFN-β的分子機理

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【摘要】：雞白痢沙門氏菌(Salmonella Pullorum)主要侵害2-3周齡以內的幼雛,引起白色下痢,病死率高。成年雞感染后,雖然不會出現(xiàn)典型的臨床癥狀,但長期處于帶菌狀態(tài),可以水平和垂直傳播病菌,對養(yǎng)禽業(yè)造成極大的危害,同時也危害公共衛(wèi)生安全。目前在西方發(fā)達國家該病已經(jīng)被凈化,而我國雞白痢仍然時常發(fā)生。目前除了淘汰感染雞仍然沒有有效的控制措施。同時,雞白痢沙門氏菌的致病機理仍不清楚。IFN-β在先天性免疫防御過程中扮演著非常重要的角色,包括抗病毒和胞內寄生菌感染以及引起細胞凋亡。本研究篩選到了雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原細菌鐵蛋白,并對該細菌鐵蛋白誘導IFN-β表達的分子機理進行了研究,為揭示沙門氏菌的致病機理提供參考。利用免疫沉淀技術(pull-down)篩選雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原,通過質譜與生物信息學分析,獲得細菌鐵蛋白(bacterioferritin, Bfr)、熱休克蛋白60 (GroEL)、乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase E, AdhE)等優(yōu)勢抗原,借助分子生物學技術將bfr基因克隆到原核表達載體pET28a (+)以及pGEX-6P-1上,經(jīng)過誘導表達與純化得到具有攝取鐵功能的重組蛋白His-Bfr和GST-Bfr。以純化的His-Bfr免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細胞融合,并以純化的GST-Bfr進行ELISA篩選,經(jīng)過三次亞克隆最后獲得了三株能夠穩(wěn)定分泌針對Bfr蛋白單抗的雜交瘤細胞系。通過對這三株單抗進行鑒定,確定這三株單抗的亞類均為IgG1,識別相同的抗原表位,同時具備高親和力、特異性強等特點。由于沙門氏菌可侵入細胞內存活和增殖,為進一步分析雞白痢沙門氏菌Bfr蛋白在宿主細胞內的生物學作用,我們構建了pEGFP-byr質粒,并以該質粒轉染雞胚成纖維細胞系(DF-1細胞)。結果表明,過表達Bfr蛋白明顯上調IFN-β表達。通過對Bfr蛋白氨基酸區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),Bfr蛋白分子的1-50位氨基酸對誘導IFN-β上調表達起著關鍵作用。為進一步分析Bfr蛋白誘導IFN-β產(chǎn)生的信號通路,我們分別以p38抑制劑和JNK抑制劑作用于DF-1細胞,觀察其對Bfr誘導IFN-β的影響。結果表明,p38抑制劑顯著抑制Bfr蛋白引起的IFN-β上調表達,同時過表達Bfr蛋白能誘導DF-1細胞內的p38蛋白發(fā)生磷酸化。然而JNK抑制劑對Bfr誘導的IFN-β沒有影響。該實驗結果說明Bfr蛋白通過p38信號轉導通路誘導IFN-β產(chǎn)生。為進一步分析Bfr在雞白痢沙門氏菌感染宿主細胞中的作用,我們通過λ-Red同源重組系統(tǒng)以野生型雞白痢沙門氏菌(WT)制備了bfr基因缺失株(KO)以及回補株(RS),并以之感染DF-1細胞。結果發(fā)現(xiàn),缺失株引起的IFN-β表達水平較野生株、回補株顯著降低,說明Bfr在雞白痢沙門氏菌誘導IFN-β表達中發(fā)揮重要作用。為進一步分析Bfr蛋白在細胞中的作用,我們以流式細胞術檢測Bfr對細胞凋亡的影響,結果發(fā)現(xiàn)在DF-1細胞中過表達Bfr蛋白明顯引起細胞凋亡,進一步在HEK 293T細胞和Hela細胞中驗證了Bfr蛋白引起的細胞凋亡與其誘導表達IFN-β有關。以上結果,說明雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原Bfr通過激活p38信號通路誘導IFN-β表達。同時,利用雞白痢沙門氏菌野生株、bfr基因缺失株及回補株感染吞噬細胞,發(fā)現(xiàn)Bfr可以明顯抑制吞噬細胞的吞噬、清除功能以及IL-12、TNF-α產(chǎn)生。綜上所述,本研究利用免疫沉淀技術篩選到了雞白痢沙門氏菌的三個優(yōu)勢抗原Bfr、GroEL、 AdhE,研究發(fā)現(xiàn)Bfr蛋白可以通過激活p38 MAPK信號通路誘導IFN-β表達。這些研究結果為建立雞白痢檢測試劑盒奠定基礎,同時為闡述雞白痢沙門氏菌的致病機理提供了重要的科學參考。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：1297863