本文關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢(shì)抗原細(xì)菌鐵蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β的分子機(jī)理

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【摘要】：雞白痢沙門氏菌(Salmonella Pullorum)主要侵害2-3周齡以內(nèi)的幼雛,引起白色下痢,病死率高。成年雞感染后,雖然不會(huì)出現(xiàn)典型的臨床癥狀,但長期處于帶菌狀態(tài),可以水平和垂直傳播病菌,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成極大的危害,同時(shí)也危害公共衛(wèi)生安全。目前在西方發(fā)達(dá)國家該病已經(jīng)被凈化,而我國雞白痢仍然時(shí)常發(fā)生。目前除了淘汰感染雞仍然沒有有效的控制措施。同時(shí),雞白痢沙門氏菌的致病機(jī)理仍不清楚。IFN-β在先天性免疫防御過程中扮演著非常重要的角色,包括抗病毒和胞內(nèi)寄生菌感染以及引起細(xì)胞凋亡。本研究篩選到了雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢(shì)抗原細(xì)菌鐵蛋白,并對(duì)該細(xì)菌鐵蛋白誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)的分子機(jī)理進(jìn)行了研究,為揭示沙門氏菌的致病機(jī)理提供參考。利用免疫沉淀技術(shù)(pull-down)篩選雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢(shì)抗原,通過質(zhì)譜與生物信息學(xué)分析,獲得細(xì)菌鐵蛋白(bacterioferritin, Bfr)、熱休克蛋白60 (GroEL)、乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase E, AdhE)等優(yōu)勢(shì)抗原,借助分子生物學(xué)技術(shù)將bfr基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a (+)以及pGEX-6P-1上,經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)與純化得到具有攝取鐵功能的重組蛋白His-Bfr和GST-Bfr。以純化的His-Bfr免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合,并以純化的GST-Bfr進(jìn)行ELISA篩選,經(jīng)過三次亞克隆最后獲得了三株能夠穩(wěn)定分泌針對(duì)Bfr蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞系。通過對(duì)這三株單抗進(jìn)行鑒定,確定這三株單抗的亞類均為IgG1,識(shí)別相同的抗原表位,同時(shí)具備高親和力、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。由于沙門氏菌可侵入細(xì)胞內(nèi)存活和增殖,為進(jìn)一步分析雞白痢沙門氏菌Bfr蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)作用,我們構(gòu)建了pEGFP-byr質(zhì)粒,并以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1細(xì)胞)。結(jié)果表明,過表達(dá)Bfr蛋白明顯上調(diào)IFN-β表達(dá)。通過對(duì)Bfr蛋白氨基酸區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),Bfr蛋白分子的1-50位氨基酸對(duì)誘導(dǎo)IFN-β上調(diào)表達(dá)起著關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步分析Bfr蛋白誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路,我們分別以p38抑制劑和JNK抑制劑作用于DF-1細(xì)胞,觀察其對(duì)Bfr誘導(dǎo)IFN-β的影響。結(jié)果表明,p38抑制劑顯著抑制Bfr蛋白引起的IFN-β上調(diào)表達(dá),同時(shí)過表達(dá)Bfr蛋白能誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞內(nèi)的p38蛋白發(fā)生磷酸化。然而JNK抑制劑對(duì)Bfr誘導(dǎo)的IFN-β沒有影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Bfr蛋白通過p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生。為進(jìn)一步分析Bfr在雞白痢沙門氏菌感染宿主細(xì)胞中的作用,我們通過λ-Red同源重組系統(tǒng)以野生型雞白痢沙門氏菌(WT)制備了bfr基因缺失株(KO)以及回補(bǔ)株(RS),并以之感染DF-1細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺失株引起的IFN-β表達(dá)水平較野生株、回補(bǔ)株顯著降低,說明Bfr在雞白痢沙門氏菌誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步分析Bfr蛋白在細(xì)胞中的作用,我們以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bfr對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)Bfr蛋白明顯引起細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步在HEK 293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞中驗(yàn)證了Bfr蛋白引起的細(xì)胞凋亡與其誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β有關(guān)。以上結(jié)果,說明雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢(shì)抗原Bfr通過激活p38信號(hào)通路誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)。同時(shí),利用雞白痢沙門氏菌野生株、bfr基因缺失株及回補(bǔ)株感染吞噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Bfr可以明顯抑制吞噬細(xì)胞的吞噬、清除功能以及IL-12、TNF-α產(chǎn)生。綜上所述,本研究利用免疫沉淀技術(shù)篩選到了雞白痢沙門氏菌的三個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原Bfr、GroEL、 AdhE,研究發(fā)現(xiàn)Bfr蛋白可以通過激活p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)。這些研究結(jié)果為建立雞白痢檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ),同時(shí)為闡述雞白痢沙門氏菌的致病機(jī)理提供了重要的科學(xué)參考。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1297863