本文關(guān)鍵詞：豬博卡病毒NP1蛋白調(diào)控Ⅰ型干擾素反應(yīng)分子機制研究

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【摘要】：天然免疫應(yīng)答是宿主抵御病毒入侵的第一道防線。I型干擾素作為主要的抗病毒效應(yīng)分子在宿主體內(nèi)廣泛表達,參與宿主免疫調(diào)控并誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)。而病毒為了有效的增殖和感染往往進化出多種策略拮抗I型干擾素反應(yīng),逃避機體的抗病毒防御。豬博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)是一種新型細(xì)小病毒,常在發(fā)生仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、腹瀉和呼吸道疾病的豬群中檢出,易與豬藍耳病毒、豬二型圓環(huán)病毒、豬流行性腹瀉病毒等病毒發(fā)生共感染,被認(rèn)為具有潛在的免疫抑制功能。PBoV編碼兩個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NP1)和兩個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2),但這些蛋白在調(diào)控宿主免疫防御中的作用鮮有報道。本研究以PBoV編碼蛋白為研究對象,發(fā)掘出NP1蛋白具有干擾素拮抗和誘導(dǎo)炎癥功能,通過研究NP1調(diào)控宿主免疫防御系統(tǒng)的機制,為闡明PBoV的致病機理和免疫逃逸策略奠定基礎(chǔ),并部分還原PBoV在感染過程中所扮演的角色。具體研究內(nèi)容包括:1.PBoV NP1負(fù)調(diào)控I型干擾素產(chǎn)生細(xì)小病毒科病毒廣泛感染不同宿主,然而其免疫逃避策略鮮有報道。本研究利用雙熒光素酶篩選到PBoV非結(jié)構(gòu)蛋白NP1能夠顯著抑制IFN-β啟動子活性以及IFN-β和IFN-α等干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。通過對RLR信號通路研究,發(fā)現(xiàn)NP1靶向IRF3或其下游分子,并且對IRF3表達、磷酸化、轉(zhuǎn)核等過程均無影響。其通過阻遏IRF3與IFN-β啟動子的結(jié)合抑制I型干擾素產(chǎn)生。2.PBoV NP1負(fù)調(diào)控I型干擾素信號級聯(lián)病毒進化出多種策略抑制干擾素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究利用雙熒光素酶報告系統(tǒng),篩選到PBoV NP1蛋白顯著抑制干擾素激活反應(yīng)元件ISRE的活化以及下游干擾素刺激因子ISG的表達。通過對JAK-STAT信號通路研究,發(fā)現(xiàn)NP1對轉(zhuǎn)錄因子STAT1/STAT2的表達、磷酸化及轉(zhuǎn)核均無影響,并且不影響轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物ISGF3的形成。其通過與ISGF3復(fù)合物發(fā)生互作影響ISGF3與ISRE的結(jié)合。3.PBoV NP1拮抗IRF3和IRF9啟動子結(jié)合的分子機制盡管一些多效性病毒蛋白可以同時靶向干擾素的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié),但是鮮有蛋白被報道通過廣譜機制同時靶向IRF3及IRF9。通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)PBoV NP1同時與IRF3及IRF9互作,并且與IRF3及IRF9的DNA結(jié)合域發(fā)生互作。細(xì)節(jié)研究表明,NP1與IRF3及IRF9 DNA結(jié)合域上關(guān)鍵氨基酸位點發(fā)生直接互作,影響IRF3和IRF9的啟動子結(jié)合活性。綜上,這些結(jié)果表明PBoV NP1采用廣譜互作機制,同時抑制干擾素的產(chǎn)生及其信號級聯(lián),拮抗I型干擾素反應(yīng)。4.PBoV NP1誘導(dǎo)NF-κB活化一些具有干擾素拮抗作用的病毒同時誘導(dǎo)NF-κB激活,促進其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及免疫抑制因子的表達。雙熒光素酶及定量試驗顯示,PBoV NP1誘導(dǎo)NF-κB啟動子活化,并且促進其下游的促炎因子表達。通過對NF-κB活化過程研究,發(fā)現(xiàn)NP1通過誘導(dǎo)IκBα降解,增加p65磷酸化,促進p65活化轉(zhuǎn)核。5.PBoV NP1亞細(xì)胞定位及免疫調(diào)控區(qū)域研究PBoV NP1蛋白具有I型干擾素應(yīng)答調(diào)控功能,然而其相應(yīng)功能域仍不清楚。通過構(gòu)建多個NP1突變體與GFP融合表達質(zhì)粒進行熒光觀察,發(fā)現(xiàn)NP1 N-端1-66氨基酸區(qū)域包含兩個經(jīng)典核定位信號序列和一個非經(jīng)典核定位信號序列。利用雙熒光素酶實驗,發(fā)現(xiàn)NP1 N-端氨基酸區(qū)域同時參與調(diào)控干擾素的產(chǎn)生及信號級聯(lián)。此外,結(jié)果顯示,NP1 C-端168-218氨基酸區(qū)域直接參與NF-κB調(diào)控,并且經(jīng)典核定位信號區(qū)顯著增強了其NF-κB調(diào)控活性。這些結(jié)果表明,PBoV NP1蛋白在其N-和C-端氨基酸區(qū)域包含與兩個獨立的功能域,分別與亞細(xì)胞定位或干擾素拮抗以及NF-κB調(diào)控相關(guān)。6.噬菌體展示系統(tǒng)篩選與PBoV NP1相互作用的宿主蛋白NP1是博卡病毒屬的獨有編碼蛋白,其功能并不完全清楚。NP1與宿主的相互關(guān)系仍需深入了解。在本研究利用原核表達系統(tǒng),得到純化的NP1蛋白,并通過T7噬菌體表面展示系統(tǒng)篩選與NP1互作的宿主蛋白。通過序列比對,在篩選陽性克隆中鑒定出與NP1發(fā)生互作的兩個宿主蛋白,鋅指蛋白APA-1和磷脂酰絲氨酸合成酶1。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

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本文編號：1267081