本文關(guān)鍵詞：茶葉兒茶素合成相關(guān)miRNA及靶基因的驗(yàn)證和表達(dá)分析

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【摘要】：兒茶素是茶葉中重要的次生代謝物,不僅對(duì)茶葉的品質(zhì)形成起著重要作用,而且是茶葉中重要的保健物質(zhì)。目前,兒茶素已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及日用品等領(lǐng)域。microRNA是植物基因表達(dá)的一類重要調(diào)控因子。miRNA參與調(diào)控植物器官的形態(tài)建成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素應(yīng)答、逆境脅迫、營(yíng)養(yǎng)代謝等植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面。miRNA對(duì)茶樹生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)理和功能研究逐步發(fā)展成為現(xiàn)代茶樹研究的新方向。目前關(guān)于兒茶素合成調(diào)控的研究大多是從環(huán)境因素和轉(zhuǎn)錄因子角度出發(fā),有關(guān)miRNA參與茶樹兒茶素生物合成的研究報(bào)道較少。本文通過生物信息學(xué)和高通量測(cè)序獲得茶樹miRNA序列信息,利用RLM-RACE和降解組測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證miRNA對(duì)兒茶素合成相關(guān)基因的調(diào)控。同時(shí)研究了茶樹DHD/SDH基因的miRNA鑒定、表達(dá)分析,及DHD/SDH在煙草中的干擾表達(dá)試驗(yàn),初步探究DHD/SDH在茶樹中功能。主要研究結(jié)果如下:1生物信息學(xué)鑒定茶樹保守miRNA以高EGCG含量的茶樹特異資源茶樹新品系'1005'轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),通過生物信息學(xué)方法挖掘茶樹中潛在的miRNA序列,獲得80個(gè)miRNA家族的92個(gè)成員。采用qPCR驗(yàn)證miRNA,檢測(cè)了 31條miRNA在茶樹1葉、3葉和老葉中的表達(dá)。對(duì)miRNA表達(dá)模式進(jìn)行分析,miRNA的表達(dá)模式有一致性,但也存在差異。通過qPCR試驗(yàn)檢測(cè)了 miRNA在不同茶樹葉片中的表達(dá)水平,這也進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性及miRNA的存在。2高通量測(cè)序法鑒定茶樹miRNA以茶樹'1005'混合葉片為樣品,利用高通量測(cè)序鑒定茶樹中保守miRNA,挖掘茶樹特異miRNA。通過測(cè)序和分析,獲得73條保守茶樹miRNA,42條茶樹新miRNAs。3利用降解組測(cè)序鑒定茶樹miRNA的靶基因以茶樹'1005'混合葉片為樣品,構(gòu)建茶樹葉片降解組文庫(kù),結(jié)合茶樹miRNA序列信息和轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分析,共獲得miRNA的26條靶基因,共檢測(cè)到26個(gè)降解位點(diǎn)。靶基因主要是轉(zhuǎn)錄因子、抗病蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其中大部分靶基因與擬南芥同源。利用RLM-RACE驗(yàn)證了 5個(gè)miRNA的5條靶基因,與降解組測(cè)序得到的結(jié)果基本一致。4兒茶素合成相關(guān)基因mRNA裂解位點(diǎn)的驗(yàn)證在生物信息學(xué)和高通量測(cè)序鑒定的茶樹miRNA信息基礎(chǔ)上,結(jié)合NCBI中登錄的兒茶合成相關(guān)基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示多條miRNA裂解兒茶素合成途徑相關(guān)基因。利用RLM-RACE法進(jìn)行裂解位點(diǎn)驗(yàn)證,結(jié)果鑒定了 14條miRNA對(duì)9條茶樹兒茶素合成相關(guān)基因的裂解。9條基因?yàn)楣鹌に嵋?-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、兩條查爾酮合成酶(Chalcone synthas,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(Chaalcone isomerase,CHI)、黃烷酮 3-羥基化酶(Flavanone 3-hydroxylase,F3H)、二氫黃烷醇 4-還原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR),及兩條花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)。C4H同時(shí)被 miR5251 和 miR7777-5P.1 裂解;miR167a 和 miR529d裂解CHI;miR7814同時(shí)裂解CHS1和CHS3,產(chǎn)生兩個(gè)裂解位點(diǎn);miR5240、miR3444b 和 miR4380a 同時(shí)可裂解DFR;miR156g-3p 靶向F3H,試驗(yàn)獲得兩個(gè)裂解位點(diǎn);miR2868裂解LAR miR5559-5p同時(shí)裂解ANR1和ANR2,miR2593e裂解ANR1。另外miR5264和miR7717c-3p裂解靶基因AVR2,且存在多個(gè)位點(diǎn)。同時(shí)驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn),靶基因還存在其他潛在剪切位點(diǎn),說明存在其他未鑒定的miRNA對(duì)兒茶素的合成起調(diào)控作用。5 miRNA及兒茶素途徑相關(guān)基因表達(dá)與兒茶素積累模式分析對(duì)茶樹'1005'扦插茶苗進(jìn)行ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA五種外源激素處理,利用高效液相色譜檢測(cè)葉片兒茶素含量。結(jié)果顯示ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA處理后酯型兒茶素含量變化與兒茶素總量變化趨勢(shì)一致。在1葉和2葉中下降,老葉中含量升高。非酯型兒茶素含量變化波動(dòng)較大。在老葉中,激素處理與對(duì)照組差異不顯著。IAA處理后,1葉中CHI、F3'5'H表達(dá)顯著上升,PAL、CHS1、F3H、ANS的表達(dá)與對(duì)照比較呈顯著下降;2葉中4CZ1、CHI表達(dá)顯著上升,僅ANS呈顯著下降趨勢(shì);老葉中PAL呈顯著上升,C4H、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、LAR、ANRI、ANR2 呈顯著下降趨勢(shì)。2,4-D處理后,4CZ1和PAL表達(dá)有提高外,其它基因表達(dá)趨勢(shì)與兒茶素含量趨勢(shì)基本一致。ETH處理后,在1葉中,F3'5'H表達(dá)顯著上升,而PAL、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、ANS表達(dá)量顯著下降。與對(duì)照相比2葉中除CHI顯著下降外,其余基因均顯著上升。老葉中,PAL、4CL1、CHI、ANS 表達(dá)顯著上升,CHS1、CHS2、CHS3、F3H、F3 '5 'H、ANR1、ANR2表達(dá)呈下降趨勢(shì)。ABA處理后,1葉中C4H、4CL1、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、CHI、F3'5'H、DFR、LAR、ANR2表達(dá)呈顯著上升,僅AVS呈顯著下降趨勢(shì)。在2葉中,苯丙烷途徑和類黃酮途徑的基因表達(dá)均呈顯著上升。在老葉中,除ANS外其他基因表達(dá)均顯著下降。6-BA處理下,在1和2葉中,多數(shù)兒茶素合成相關(guān)基因表達(dá)呈顯著上升,但也有例外,1葉中F3H和ANS表達(dá)差異不顯著,2葉中CHI和F3H差異不顯著。在老葉中,4CL2、CHS1、HHS2、CHS3、CHI、F3H、DFR、ANR1、ANR2呈顯著下降趨勢(shì),其他基因差異不顯著。采用qPCR檢測(cè)外源激素處理下miRNA與靶基因的表達(dá)模式。miR156g-3p 與靶基因 F3H,miR2868 與靶基因 LAR,miR529d 和miR167a與靶基因CHI表達(dá)基本呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因起著負(fù)調(diào)控作用,抑制其表達(dá)。DFR同時(shí)被miR5240、miR3444b和miR4380a調(diào)控。分析三條miRNA的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),外源激素處理下三條miRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。說明miR5240、miR3444b 和 miR4380a 三條 miRNA 共同介導(dǎo) DFR的轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)調(diào)控。miR7814與靶基因CHS表達(dá)并未完全呈負(fù)相關(guān),原因可能是同一 miRNA靶向同一家族成員基因,其對(duì)不同成員的調(diào)控強(qiáng)弱存在差異,另一方面可能是受到多個(gè)調(diào)控因子調(diào)控。ANR、C4H受兩條及以上miRNA的調(diào)控,miRNA與靶基因的表達(dá)并未呈負(fù)顯著的調(diào)控模式。靶基因同時(shí)受多條miRNA的調(diào)控,不同發(fā)育成度葉片或外源激素的刺激時(shí),可能會(huì)不啟動(dòng)不同的調(diào)控方式,如共同調(diào)控靶基因表達(dá),或不同調(diào)控因子功能互補(bǔ)。6莽草酸途徑3-脫氫奎尼酸脫水酶/莽草酸脫氫酶表達(dá)調(diào)控及功能研究?jī)翰杷厣锖铣芍饕婕暗耐緩?莽草酸途徑、苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑。莽草酸途徑是連接初級(jí)代謝和次生代謝的重要橋梁。3-脫氫奎尼酸脫水酶/莽草酸脫氫酶(DHD/SDH)是莽草酸中唯一的雙功能酶。在獲得的茶樹miRNA序列的基礎(chǔ)上,對(duì)本試驗(yàn)室克隆得到的茶樹三條DHD/SDH進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)和鑒定。獲得了 4條miRNA參與裂解CsDHD/SDH。其中 miR5180b、miR1510b-5p 和 miR24 共同靶向CsDHD/SDH2,miR868-5p 作用于CsDHD/SDH3。同時(shí)對(duì)茶樹中三條CsDHD/SDH表達(dá)模式進(jìn)行了檢測(cè)。不同激素處理下,CsDHD/SDH2 和 CsDHD/SDH3表達(dá)模式一致。CsDHD/SDH2 和CsDHD/SDH3的表達(dá)模式存在協(xié)同作用。CsDHD/SDH1與CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之間的表達(dá)存在負(fù)反饋調(diào)節(jié),CsDHD/SDH1上調(diào)表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致互補(bǔ)基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下調(diào)表達(dá)。為進(jìn)一步分析茶樹CsDHD/SDH功能,我們構(gòu)建了茶樹CsDHD/SDH1干擾載體,并轉(zhuǎn)化至煙草中,獲得了 T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株。通過熒光定量檢測(cè)分析顯示CsDHD/SDH1干擾載體表達(dá)后導(dǎo)致煙草自身NtDHD/SDH1表達(dá)下調(diào),但促使煙草自身NtDHD/SDH2表達(dá)上調(diào)。同時(shí)T1代轉(zhuǎn)基因煙草類黃酮含量降低。說明DHD/SDH1在植物的類黃酮的合成中具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S571.1;Q943.2
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本文編號(hào)：1267032