發(fā)布時間：2017-12-08 18:10

  本文關鍵詞：結核分枝桿菌感染巨噬細胞過程中STAT1介導的信號轉導和免疫調控的機理研究

  更多相關文章： STAT1 結核桿菌 巨噬細胞 蛋白相互作用組 小鼠

【摘要】：結核病是由結核桿菌引起的一種人畜共患傳染病,病原菌可通過病畜傳播給人群。其中牛結核分枝桿菌比同屬的其他結核桿菌菌種對其他種類的動物的傳播性更廣泛。結核病的傳播流行不僅影響畜牧業(yè)的發(fā)展,而且嚴重威脅人類的健康。至今為止,牛結核病造成的損失遠遠超過其他疫病造成的損失的總數。而在那些牛結核病流行的國家,由于有效的藥物缺乏和耐藥菌種的不斷出現,人類結核病得不到有效的控制,成為了成年人傳染病的首要殺手,對公共衛(wèi)生造成了極大的損害。要從根本上解決這個問題,必須從結核病的感染機理上進行深入研究。結核桿菌是引起結核病的一種胞內寄生菌。結核桿菌感染宿主后,可被宿主體內的巨噬細胞吞噬。結核菌可由巨噬細胞經吞噬作用直接消除,也可在巨噬細胞中長期存活。凋亡途徑是巨噬細胞的天然免疫屏障作用,可限制結核菌在宿主內的繁殖和擴增。結核桿菌通過結合細胞表面Toll樣受體后激活巨噬細胞�；罨木奘杉毎ㄟ^細胞內多條信號通路,誘導自身凋亡,達到清除病原菌的目的。然而隨著病菌和宿主免疫系統(tǒng)的共同進化,結核桿菌也進化出通過降低巨噬細胞凋亡率的方式獲得免疫逃逸的生存機會。本文主要研究了結核桿菌H37Ra感染RAW264.7小鼠巨噬細胞系,巨噬細胞中JAK/STAT通路介導的免疫調控。本研究的主要研究內容如下:1.在結核桿菌感染巨噬細胞早期(1小時內),細胞內JAK/STAT通路快速激活,STAT1迅速磷酸化,下游促凋亡因子活化轉錄。腫瘤壞死因子表達升高,Caspase-3剪切體增多,巨噬細胞凋亡率上升。加入磷酸化抑制劑AG490后,STAT1磷酸化受阻,腫瘤壞死因子和Caspase-3的表達降低,巨噬細胞的凋亡率下降。2.在結核桿菌感染巨噬細胞后期(48小時),隨著感染時間的延長,細胞內磷酸化STAT1含量下降,相反,細胞中非磷酸化STAT1蛋白大量積累。非磷酸化STAT1的濃度的升高和細胞內的活菌量的升高趨勢一致。為了進一步研究非磷酸化STAT1蛋白在結核感染的巨噬細胞中的功能,本研究構建了穩(wěn)定表達磷酸化位點突變的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬細胞系。實驗結果表明,巨噬細胞感染結核菌后,非磷酸化STAT1蛋白發(fā)生進核效應,并調控下游一系列免疫及凋亡相關基因的轉錄。并且,非磷酸化STAT1蛋白的表達影響細胞中Caspase-3的激活,細胞色素c的釋放,而增強表達抗凋亡蛋白Mcl-1的含量。Jak1是STAT1磷酸化的重要激酶,非磷酸化STAT1通過抑制Jak1激酶的表達,負反饋調節(jié)抑制STAT1的磷酸化。3.為更好的研究非磷酸化STAT1蛋白的調控模式,本研究利用RAW264.7小鼠巨噬細胞系為模型研究了非磷酸化STAT1蛋白相互作用組。構建了穩(wěn)定表達生物素修飾的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬細胞系。采用鏈親合素親和純化技術捕獲非磷酸化STAT1蛋白復合物,利用質譜測序技術鑒定出其149種相互作用蛋白。免疫印跡實驗驗證了部分相互作用靶蛋白。生物信息學聚類分析發(fā)現相互作用蛋白組富集在抗原呈遞和疾病反應等重要免疫信號通路上。4.進一步研究表明,非磷酸化STAT1與STAT3形成異源二聚體,結合在CD95基因啟動子上,調控CD95的轉錄,進一步抑制巨噬細胞中CD95/CD95L介導的細胞凋亡。另外,細胞質中非磷酸化STAT1可競爭性結合在其另一個靶蛋白eEF1A上,破壞促凋亡復合體eEF1A/IFIT1的穩(wěn)定性,導致細胞凋亡被抑制。綜上所述,STAT1轉錄蛋白在結核桿菌感染小鼠巨噬細胞的過程中扮演了雙刃劍的角色。結核桿菌感染早期,磷酸化STAT1促進巨噬細胞凋亡作用,發(fā)揮病原菌抑制子的作用;感染后期,非磷酸化STAT1抑制巨噬細胞凋亡作用,利于結核菌在細胞內存活和增殖,造成結核桿菌的免疫逃逸。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.618

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