本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中STAT1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)控的機(jī)理研究

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【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病,病原菌可通過(guò)病畜傳播給人群。其中牛結(jié)核分枝桿菌比同屬的其他結(jié)核桿菌菌種對(duì)其他種類(lèi)的動(dòng)物的傳播性更廣泛。結(jié)核病的傳播流行不僅影響畜牧業(yè)的發(fā)展,而且嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。至今為止,牛結(jié)核病造成的損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他疫病造成的損失的總數(shù)。而在那些牛結(jié)核病流行的國(guó)家,由于有效的藥物缺乏和耐藥菌種的不斷出現(xiàn),人類(lèi)結(jié)核病得不到有效的控制,成為了成年人傳染病的首要?dú)⑹?對(duì)公共衛(wèi)生造成了極大的損害。要從根本上解決這個(gè)問(wèn)題,必須從結(jié)核病的感染機(jī)理上進(jìn)行深入研究。結(jié)核桿菌是引起結(jié)核病的一種胞內(nèi)寄生菌。結(jié)核桿菌感染宿主后,可被宿主體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。結(jié)核菌可由巨噬細(xì)胞經(jīng)吞噬作用直接消除,也可在巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活。凋亡途徑是巨噬細(xì)胞的天然免疫屏障作用,可限制結(jié)核菌在宿主內(nèi)的繁殖和擴(kuò)增。結(jié)核桿菌通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面Toll樣受體后激活巨噬細(xì)胞�；罨木奘杉�(xì)胞通過(guò)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路,誘導(dǎo)自身凋亡,達(dá)到清除病原菌的目的。然而隨著病菌和宿主免疫系統(tǒng)的共同進(jìn)化,結(jié)核桿菌也進(jìn)化出通過(guò)降低巨噬細(xì)胞凋亡率的方式獲得免疫逃逸的生存機(jī)會(huì)。本文主要研究了結(jié)核桿菌H37Ra感染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系,巨噬細(xì)胞中JAK/STAT通路介導(dǎo)的免疫調(diào)控。本研究的主要研究?jī)?nèi)容如下:1.在結(jié)核桿菌感染巨噬細(xì)胞早期(1小時(shí)內(nèi)),細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT通路快速激活,STAT1迅速磷酸化,下游促凋亡因子活化轉(zhuǎn)錄。腫瘤壞死因子表達(dá)升高,Caspase-3剪切體增多,巨噬細(xì)胞凋亡率上升。加入磷酸化抑制劑AG490后,STAT1磷酸化受阻,腫瘤壞死因子和Caspase-3的表達(dá)降低,巨噬細(xì)胞的凋亡率下降。2.在結(jié)核桿菌感染巨噬細(xì)胞后期(48小時(shí)),隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT1含量下降,相反,細(xì)胞中非磷酸化STAT1蛋白大量積累。非磷酸化STAT1的濃度的升高和細(xì)胞內(nèi)的活菌量的升高趨勢(shì)一致。為了進(jìn)一步研究非磷酸化STAT1蛋白在結(jié)核感染的巨噬細(xì)胞中的功能,本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)磷酸化位點(diǎn)突變的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,巨噬細(xì)胞感染結(jié)核菌后,非磷酸化STAT1蛋白發(fā)生進(jìn)核效應(yīng),并調(diào)控下游一系列免疫及凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。并且,非磷酸化STAT1蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞中Caspase-3的激活,細(xì)胞色素c的釋放,而增強(qiáng)表達(dá)抗凋亡蛋白Mcl-1的含量。Jak1是STAT1磷酸化的重要激酶,非磷酸化STAT1通過(guò)抑制Jak1激酶的表達(dá),負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制STAT1的磷酸化。3.為更好的研究非磷酸化STAT1蛋白的調(diào)控模式,本研究利用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系為模型研究了非磷酸化STAT1蛋白相互作用組。構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)生物素修飾的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬細(xì)胞系。采用鏈親合素親和純化技術(shù)捕獲非磷酸化STAT1蛋白復(fù)合物,利用質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)鑒定出其149種相互作用蛋白。免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了部分相互作用靶蛋白。生物信息學(xué)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白組富集在抗原呈遞和疾病反應(yīng)等重要免疫信號(hào)通路上。4.進(jìn)一步研究表明,非磷酸化STAT1與STAT3形成異源二聚體,結(jié)合在CD95基因啟動(dòng)子上,調(diào)控CD95的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞中CD95/CD95L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另外,細(xì)胞質(zhì)中非磷酸化STAT1可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在其另一個(gè)靶蛋白eEF1A上,破壞促凋亡復(fù)合體eEF1A/IFIT1的穩(wěn)定性,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制。綜上所述,STAT1轉(zhuǎn)錄蛋白在結(jié)核桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞的過(guò)程中扮演了雙刃劍的角色。結(jié)核桿菌感染早期,磷酸化STAT1促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡作用,發(fā)揮病原菌抑制子的作用;感染后期,非磷酸化STAT1抑制巨噬細(xì)胞凋亡作用,利于結(jié)核菌在細(xì)胞內(nèi)存活和增殖,造成結(jié)核桿菌的免疫逃逸。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.618

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