小麥條銹菌致病相關(guān)基因鑒定及其功能研究
發(fā)布時間:2017-11-10 10:13
本文關(guān)鍵詞:小麥條銹菌致病相關(guān)基因鑒定及其功能研究
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【摘要】:由條形柄銹菌小麥�;�(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的條銹病是小麥生產(chǎn)上的一種重要真菌病害。目前生產(chǎn)上主要利用抗病品種來防治小麥條銹病。但是小麥抗病品種容易隨著條銹菌致病性的不斷變異而喪失抗性,導(dǎo)致條銹病持續(xù)威脅著全球小麥生產(chǎn)和糧食安全。因此解析小麥條銹菌的致病及其變異機制對開發(fā)新的持久防治條銹病策略具有重要意義。本論文在小麥條銹菌全基因組測序基礎(chǔ)上,對致病效應(yīng)基因(Effector gene)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的Ras和激酶基因開展研究,明確它們在病菌侵染致病中的作用。該研究為全面揭示小麥條銹菌的致病機理奠定基礎(chǔ),進而為小麥條銹病的持久控制新策略的制定提供重要的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.效應(yīng)基因的鑒定與功能解析借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PVX病毒表達系統(tǒng),在模式植物本氏煙中高通量表達了26個小麥條銹菌候選效應(yīng)基因,從中鑒定到了6個能夠抑制BAX誘導(dǎo)PCD的條銹菌效應(yīng)基因。通過酵母分泌系統(tǒng)證實了這6個效應(yīng)基因編碼的蛋白(效應(yīng)蛋白)均為典型的分泌蛋白。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)其中的4個效應(yīng)基因(Ps4884、Ps4941、Ps5278和Ps5578)在條銹菌侵染小麥過程中誘導(dǎo)表達,而Ps4593和Ps5086則在其侵染過程中下調(diào)表達。小麥條銹菌效應(yīng)基因呈現(xiàn)不同的表達模式暗示它們可能在不同侵染時期發(fā)揮功能。利用細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)將這6個條銹菌效應(yīng)基因在其寄主小麥中進行瞬時表達,從而明確了它們的毒性和無毒性功能。結(jié)果表明除Ps4593之外的5個效應(yīng)基因均能抑制非病原細(xì)菌激發(fā)的小麥PTI防衛(wèi)反應(yīng),且所有的6個效應(yīng)基因均能抑制小麥與無毒性條銹菌菌系互作中的ETI反應(yīng)。這表明鑒定到的小麥條銹菌效應(yīng)基因具有顯著的毒性功能。另一方面,通過大規(guī)模篩選發(fā)現(xiàn)Ps4884、Ps4941和Ps5578這三個不同的效應(yīng)基因均能在Yr1近等基因系的小麥材料上誘導(dǎo)過敏性反應(yīng)(HR)類似細(xì)胞壞死,而Ps4941同時還能在Yr7近等基因系的小麥材料上誘導(dǎo)HR類似細(xì)胞壞死。這些結(jié)果表明Ps4884、Ps4941和Ps5578為候選的條銹菌無毒基因,也揭示了多個條銹菌無毒基因可與同一個小麥抗病基因識別,而單個條銹菌無毒基因也可與多個小麥抗病基因識別。在煙草中對這6個小麥條銹菌效應(yīng)蛋白進行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)它們均位于煙草細(xì)胞內(nèi),屬于典型的胞內(nèi)效應(yīng)蛋白。同時大豆根部吸收實驗發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白與GFP的融合蛋白在沒有病原菌介導(dǎo)的情況下能夠進入大豆的根尖細(xì)胞,這表明了小麥條銹菌效應(yīng)蛋白可不依賴于病原菌的存在而轉(zhuǎn)運進入寄主細(xì)胞內(nèi)。序列分析發(fā)現(xiàn)這6個效應(yīng)蛋白均不含卵菌效應(yīng)蛋白中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運的RXLR基序,推測小麥條銹菌效應(yīng)蛋白與卵菌效應(yīng)蛋白具有不同的轉(zhuǎn)運方式。禾谷類白粉菌中預(yù)測的Y/F/Wx C基序在其中的4個小麥條銹菌效應(yīng)蛋白存在,然而該基序的突變體并不能改變其小麥條銹菌效應(yīng)蛋白在煙草中的亞細(xì)胞定位和抑制BAX誘導(dǎo)PCD的毒性功能。這表明Y/F/Wx C基序并不負(fù)責(zé)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運和毒性功能。2.關(guān)鍵效應(yīng)基因的靶標(biāo)鑒定在之前鑒定得到的6個小麥條銹菌效應(yīng)基因中,我們選取了兩個關(guān)鍵的效應(yīng)基因進行毒性機制研究。Ps KE1(Ps5578)和Ps KE2(Ps4941)具有相似的轉(zhuǎn)錄表達水平和毒性功能。分析發(fā)現(xiàn)它們雖然在蛋白序列上具有較低的相似性,但在蛋白的一級結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)技術(shù)將它們沉默后會導(dǎo)致條銹菌在寄主小麥上的致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中條銹菌的菌絲發(fā)育受到抑制,同時寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)增強。這些結(jié)果表明Ps KE1和Ps KE2很可能通過抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)來參與條銹菌在小麥上的毒性。利用酵母雙雜的方法,篩選到三個來自不同家族的小麥靶標(biāo)蛋白與Ps KE1蛋白進行互作,分別為Ta PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1。同時Ta PKDM7-1和Ta Trx-m4也能與Ps KE2蛋白進行互作。進一步的酵母雙雜實驗表明Ps KE1不能與Ps KE2互作,而這三個小麥靶標(biāo)蛋白之間也無明顯的互作。對效應(yīng)蛋白和靶標(biāo)蛋白在小麥原生質(zhì)體中進行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)Ps KE1和Ps KE2均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,而Ta PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1也分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這些結(jié)果證實了這兩個條銹菌效應(yīng)蛋白與其小麥靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中進行互作的可能性。而雙分子熒光互補(BIFC)實驗證明了這兩個條銹菌效應(yīng)蛋白與其小麥靶標(biāo)蛋白確實能在植物體內(nèi)互作。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)這三個小麥靶標(biāo)基因均受條銹菌侵染誘導(dǎo)表達,且表達高峰期與Ps KE1和Ps KE2的高峰期一致。利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)沉默這三個小麥靶標(biāo)后導(dǎo)致條銹菌致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中的條銹菌菌絲發(fā)育受到抑制,同時其寄主防衛(wèi)反應(yīng)增強。這些結(jié)果表明這三個小麥靶標(biāo)基因很可能通過抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)來參與小麥對條銹菌的感病性。3.明確兩個不同Ras基因在致病性和細(xì)胞程序性死亡中的分化功能在小麥條銹菌基因組鑒定了兩個不同的Ras基因,Ps Ras1和Ps Ras2。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌的兩個Ras基因?qū)儆趦蓚€不同的進化分支。和其它絲狀真菌的Ras2蛋白相比,禾谷類銹菌和同屬擔(dān)子菌的玉米瘤黑粉菌的Ras2蛋白有明顯的序列缺失。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)Ps Ras1和Ps Ras2具有不同的轉(zhuǎn)錄表達特征,分別在條銹菌侵染小麥過程中下調(diào)和上調(diào)表達。利用HIGS技術(shù)分別將Ps Ras1和Ps Ras2進行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ps Ras1和Ps Ras2沉默植株的吸器數(shù)目都減少,然而侵染菌絲的長度只在Ps Ras2沉默植株上變短,在Ps Ras1沉默植株上無明顯變化。最終的致病表型也只在Ps Ras2沉默植株上減弱,在Ps Ras1沉默植株上無明顯變化。這表明與Ps Ras1相比,Ps Ras2在條銹菌的致病性中起著更加重要的作用。然而將條銹菌Ras基因與小麥赤霉菌ras2突變體進行互補實驗發(fā)現(xiàn),Ps Ras2并不能恢復(fù)赤霉菌ras2突變體在菌絲生長方面的缺陷。這表明小麥條銹菌和赤霉菌的Ras2基因在功能上的差異性。Ps Ras1雖在小麥條銹菌的致病性中起著較小的作用,但將其在植物系統(tǒng)中瞬時表達后能夠引起植物的細(xì)胞程序性死亡(PCD),Ps Ras2則不能。進一步發(fā)現(xiàn),Ps Ras1蛋白中所有Ras蛋白保守結(jié)構(gòu)域均負(fù)責(zé)PCD的誘導(dǎo)。同時Ps Ras1誘導(dǎo)的植物PCD表現(xiàn)出和植物HR類似的細(xì)胞學(xué)特征,并依賴于植物的一個MAPK級聯(lián)途徑,該MAPK級聯(lián)途徑已知也參與了植物HR。這些結(jié)果表明Ps Ras1誘導(dǎo)的植物PCD和植物HR具有類似的機制。4.禾谷類銹菌特有激酶基因Ps SRPKL是小麥條銹菌重要的致病因子在小麥條銹菌吸器庫中鑒定到了一個新穎的激酶基因Ps SRPKL。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL在條銹菌侵染小麥過程中高量誘導(dǎo)表達,同時也在侵染轉(zhuǎn)主寄主小檗中誘導(dǎo)表達。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL屬于禾谷類銹菌進化上特有的激酶基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL具有高水平的種內(nèi)序列多態(tài)性,且突變氨基酸集中于其激酶結(jié)構(gòu)域。同時在煙草和擬南芥中的亞細(xì)胞定位實驗均發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL定位于細(xì)胞核。在裂殖酵母中過表達Ps SRPKL后會引起酵母細(xì)胞的形態(tài)畸形,同時降低酵母細(xì)胞對環(huán)境脅迫(包括氧脅迫和高滲脅迫)的抗性。利用HIGS技術(shù)將Ps SRPKL進行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ps SRPKL沉默植株的條銹菌致病表型減弱。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)沉默植株中的條銹菌的菌絲發(fā)育受到抑制,同時寄主植物的活性氧積累增加。這些結(jié)果表明Ps SRPKL是一個重要的條銹菌致病因子,通過調(diào)控菌絲發(fā)育和環(huán)境脅迫抗性來參與條銹菌在小麥上的致病性。
【學(xué)位授予單位】:西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:S435.121.42
【參考文獻】
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1 厲曉東;盧建平;李海嬌;林福呈;;絲狀真菌的細(xì)胞凋亡[J];微生物學(xué)通報;2011年02期
,本文編號:1166187
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