本文關(guān)鍵詞：雙殼類C型凝集素免疫功能及分子識別機制的研究

  更多相關(guān)文章： 雙殼類 固有免疫 C型凝集素 PAMPs識別 調(diào)理作用

【摘要】：C型凝集素是一類含有鈣離子(Ca2+)依賴糖識別域(Carbonhydraterecognition domain,CRD)的蛋白超家族,是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體(Pattern-recognition receptor,PRR)。本論文綜合利用分子生物學、免疫學、生物信息學等技術(shù),以雙殼類櫛孔扇貝Chlamys farreri、海灣扇貝Argopecten irradians和長牡蠣Crassostrea gigas為材料,開展了含多個CRD的C型凝集素(CfLec-4)、含單個CRD的C型凝集素(AiCTL-2、AiCTL-3、AiCTL-4、AiCTL-7)和錨定在膜上的C型凝集素(CgCLec-5)的克隆與表達研究,結(jié)合結(jié)構(gòu)特征探討了其糖識別機制,闡釋了雙殼類C型凝集素在免疫防御中的作用。櫛孔扇貝C型凝集素CfLec-4含四個CRD結(jié)構(gòu)域,其Ca2+結(jié)合位點2關(guān)鍵氨基酸基序分別含EPD/LSD、EPN/FAD、EPN/LND和EPN/YND。該蛋白在櫛孔扇貝的肝胰腺、腎和性腺中特異性分布。當櫛孔扇貝受到脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)和β-葡聚糖(β-glucan)刺激后,血淋巴細胞中Cf Lec-4的mRNA表達水平顯著上升。Cf Lec-4的重組蛋白(rCfLec-4)能在體外結(jié)合LPS、PGN、Glucan和甘露聚糖(Mannan),而對脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)無結(jié)合活性。rCfLec-4能結(jié)合藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鰻弧菌(Vibrio auguillarum)、大腸桿菌(Escherichia coli)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。Cf Lec-4具有調(diào)理作用能顯著促進櫛孔扇貝血淋巴細胞對病原菌的吞噬。CfLec-4的四個CRD結(jié)構(gòu)域(rCRD1,rCRD2,rCRD3和rCRD4)具有不同的PAMPs結(jié)合譜及結(jié)合活性。rCRD3和rCRD4均能結(jié)合LPS、PGN、Glucan和Mannan,而rCRD1和rCRD2僅結(jié)合LPS和Mannan。rCRD3對glucan、LPS和Mannan的結(jié)合活性較強,而rCRD4對PGN表現(xiàn)出較強的結(jié)合活性。四個CRD的菌結(jié)合譜也有較大差異,其中rCRD3具有與rCf Lec-4一致廣譜的菌結(jié)合活性。另外,rCRD1、rCRD3和rCRD4能顯著促進櫛孔扇貝血淋巴細胞對大腸桿菌的吞噬,而rCRD2未檢測到促吞噬活性。結(jié)果表明,Cf Lec-4作為模式識別受體具有廣譜的免疫識別活性,其四個CRD具有不同的PAMPs與外源微生物識別譜及識別活性和促吞噬活性,出現(xiàn)了免疫功能的分化。本論文對海灣扇貝中Ca2+結(jié)合位點2含EPD/WSD的C型凝集素Ai CTL-7進行了免疫活性研究。發(fā)現(xiàn)raictl-7能結(jié)合lps、pgn、mannan、glucan和聚肌苷酸胞苷酸(polyi:c),具有廣譜的pamps結(jié)合活性,并能特異性結(jié)合甘露糖(d-mannose)和半乳糖(d-galactose)兩種單糖。raictl-7能結(jié)合耶羅維亞酵母、畢赤酵母、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌,并能凝集包括金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、耶羅維亞酵母和畢赤酵母在內(nèi)的多種微生物。raictl-7能在較低的蛋白濃度(0.59μgml-1)下凝集兔血細胞。raictl-7與大腸桿菌孵育后能顯著抑制大腸桿菌的生長。結(jié)果表明作為模式識別受體,含單個crd的c型凝集素aictl-7具有廣譜的pamps和微生物識別活性及凝菌和抑菌活性。本論文對海灣扇貝中ca2+結(jié)合位點2含epn基序的三個c型凝集素(aictl-2,aictl-3和aictl-4)的免疫活性進行了比較研究。發(fā)現(xiàn)三個c型凝集素的組織分布規(guī)律相似,在扇貝的肌肉、血細胞、外套膜、鰓、性腺和肝胰腺等組織呈組成型表達,并以肝胰腺中的表達水平最高。三個c型凝集素具有相似的pamps結(jié)合譜,其中raictl-3和raictl-4能結(jié)合lps、pgn和glucan,raictl-2能結(jié)合lps和pgn,但三個c型凝集素均不能結(jié)合mannan。進一步研究發(fā)現(xiàn)它們對同一種pamp的結(jié)合強度存在差異,其中raictl-2對lps和pgn的結(jié)合活性較強,而raictl-4對glucan具有較強的結(jié)合活性。raictl-2與raictl-4僅結(jié)合金黃色葡萄球菌,而raictl-3能結(jié)合金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鰻弧菌,具有相對廣譜的菌結(jié)合活性。raictl-4在較低蛋白濃度(6.25μgml-1)下仍具有較強的凝集兔血細胞的活性,而raictl-2和raictl-3的凝集活性較弱。另外,raictl-2,raictl-3和raictl-4都能顯著促進海灣扇貝血淋巴細胞對大腸桿菌的吞噬活性。結(jié)果表明aictl-2,aictl-3和aictl-4作為模式識別受體能結(jié)合pamps及微生物。但由于關(guān)鍵結(jié)合位點的差異,三個c型凝集素具有不同的pamps結(jié)合活性和菌結(jié)合譜,其凝集活性也有較大差異。本論文對長牡蠣中錨定在膜上的c型凝集素cgclec-5胞外段crd結(jié)構(gòu)域進行了基因克隆和蛋白重組表達。發(fā)現(xiàn)cgclec-5蛋白主要分布于血淋巴細胞表面、鰓、神經(jīng)節(jié)和外套膜中。胞外段crd結(jié)構(gòu)域能結(jié)合lps、pgn和mannan。cgclec-5能顯著促進長牡蠣血淋巴細胞對燦爛弧菌(vibrosplendidus)的吞噬。本論文研究的c型凝集素能作為模式識別蛋白識別并結(jié)合pamps及微生物,能凝集微生物并抑制微生物的生長,還能作為調(diào)理素促進血淋巴細胞對微生物的吞噬作用,在雙殼類動物免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。研究成果為深入了解雙殼類免疫識別分子的結(jié)構(gòu)與功能,闡明軟體動物的免疫防御機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳月;余新沛;劉瑩;陳政良;;MBL對LPS誘導樹突狀細胞成熟的調(diào)節(jié)作用[J];免疫學雜志;2006年04期

2 王凡平;王明永;楊建斌;趙東方;王紅坡;邵峰;孫瑞利;郭慶合;凌明智;趙永新;宋士軍;郭繼強;;甘露聚糖結(jié)合凝集素誘導DC成熟機制分析[J];中國免疫學雜志;2012年12期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊嘉龍;櫛孔扇貝關(guān)鍵模式識別受體介導的免疫應(yīng)答機制研究[D];中國科學院研究生院（海洋研究所）;2011年

，

本文編號：1165371