本文關(guān)鍵詞：雙殼類C型凝集素免疫功能及分子識(shí)別機(jī)制的研究

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【摘要】：C型凝集素是一類含有鈣離子(Ca2+)依賴糖識(shí)別域(Carbonhydraterecognition domain,CRD)的蛋白超家族,是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptor,PRR)。本論文綜合利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù),以雙殼類櫛孔扇貝Chlamys farreri、海灣扇貝Argopecten irradians和長牡蠣Crassostrea gigas為材料,開展了含多個(gè)CRD的C型凝集素(CfLec-4)、含單個(gè)CRD的C型凝集素(AiCTL-2、AiCTL-3、AiCTL-4、AiCTL-7)和錨定在膜上的C型凝集素(CgCLec-5)的克隆與表達(dá)研究,結(jié)合結(jié)構(gòu)特征探討了其糖識(shí)別機(jī)制,闡釋了雙殼類C型凝集素在免疫防御中的作用。櫛孔扇貝C型凝集素CfLec-4含四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域,其Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2關(guān)鍵氨基酸基序分別含EPD/LSD、EPN/FAD、EPN/LND和EPN/YND。該蛋白在櫛孔扇貝的肝胰腺、腎和性腺中特異性分布。當(dāng)櫛孔扇貝受到脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)和β-葡聚糖(β-glucan)刺激后,血淋巴細(xì)胞中Cf Lec-4的mRNA表達(dá)水平顯著上升。Cf Lec-4的重組蛋白(rCfLec-4)能在體外結(jié)合LPS、PGN、Glucan和甘露聚糖(Mannan),而對(duì)脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)無結(jié)合活性。rCfLec-4能結(jié)合藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鰻弧菌(Vibrio auguillarum)、大腸桿菌(Escherichia coli)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。Cf Lec-4具有調(diào)理作用能顯著促進(jìn)櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬。CfLec-4的四個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域(rCRD1,rCRD2,rCRD3和rCRD4)具有不同的PAMPs結(jié)合譜及結(jié)合活性。rCRD3和rCRD4均能結(jié)合LPS、PGN、Glucan和Mannan,而rCRD1和rCRD2僅結(jié)合LPS和Mannan。rCRD3對(duì)glucan、LPS和Mannan的結(jié)合活性較強(qiáng),而rCRD4對(duì)PGN表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合活性。四個(gè)CRD的菌結(jié)合譜也有較大差異,其中rCRD3具有與rCf Lec-4一致廣譜的菌結(jié)合活性。另外,rCRD1、rCRD3和rCRD4能顯著促進(jìn)櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬,而rCRD2未檢測到促吞噬活性。結(jié)果表明,Cf Lec-4作為模式識(shí)別受體具有廣譜的免疫識(shí)別活性,其四個(gè)CRD具有不同的PAMPs與外源微生物識(shí)別譜及識(shí)別活性和促吞噬活性,出現(xiàn)了免疫功能的分化。本論文對(duì)海灣扇貝中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2含EPD/WSD的C型凝集素Ai CTL-7進(jìn)行了免疫活性研究。發(fā)現(xiàn)raictl-7能結(jié)合lps、pgn、mannan、glucan和聚肌苷酸胞苷酸(polyi:c),具有廣譜的pamps結(jié)合活性,并能特異性結(jié)合甘露糖(d-mannose)和半乳糖(d-galactose)兩種單糖。raictl-7能結(jié)合耶羅維亞酵母、畢赤酵母、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌,并能凝集包括金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、耶羅維亞酵母和畢赤酵母在內(nèi)的多種微生物。raictl-7能在較低的蛋白濃度(0.59μgml-1)下凝集兔血細(xì)胞。raictl-7與大腸桿菌孵育后能顯著抑制大腸桿菌的生長。結(jié)果表明作為模式識(shí)別受體,含單個(gè)crd的c型凝集素aictl-7具有廣譜的pamps和微生物識(shí)別活性及凝菌和抑菌活性。本論文對(duì)海灣扇貝中ca2+結(jié)合位點(diǎn)2含epn基序的三個(gè)c型凝集素(aictl-2,aictl-3和aictl-4)的免疫活性進(jìn)行了比較研究。發(fā)現(xiàn)三個(gè)c型凝集素的組織分布規(guī)律相似,在扇貝的肌肉、血細(xì)胞、外套膜、鰓、性腺和肝胰腺等組織呈組成型表達(dá),并以肝胰腺中的表達(dá)水平最高。三個(gè)c型凝集素具有相似的pamps結(jié)合譜,其中raictl-3和raictl-4能結(jié)合lps、pgn和glucan,raictl-2能結(jié)合lps和pgn,但三個(gè)c型凝集素均不能結(jié)合mannan。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它們對(duì)同一種pamp的結(jié)合強(qiáng)度存在差異,其中raictl-2對(duì)lps和pgn的結(jié)合活性較強(qiáng),而raictl-4對(duì)glucan具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。raictl-2與raictl-4僅結(jié)合金黃色葡萄球菌,而raictl-3能結(jié)合金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鰻弧菌,具有相對(duì)廣譜的菌結(jié)合活性。raictl-4在較低蛋白濃度(6.25μgml-1)下仍具有較強(qiáng)的凝集兔血細(xì)胞的活性,而raictl-2和raictl-3的凝集活性較弱。另外,raictl-2,raictl-3和raictl-4都能顯著促進(jìn)海灣扇貝血淋巴細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬活性。結(jié)果表明aictl-2,aictl-3和aictl-4作為模式識(shí)別受體能結(jié)合pamps及微生物。但由于關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的差異,三個(gè)c型凝集素具有不同的pamps結(jié)合活性和菌結(jié)合譜,其凝集活性也有較大差異。本論文對(duì)長牡蠣中錨定在膜上的c型凝集素cgclec-5胞外段crd結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了基因克隆和蛋白重組表達(dá)。發(fā)現(xiàn)cgclec-5蛋白主要分布于血淋巴細(xì)胞表面、鰓、神經(jīng)節(jié)和外套膜中。胞外段crd結(jié)構(gòu)域能結(jié)合lps、pgn和mannan。cgclec-5能顯著促進(jìn)長牡蠣血淋巴細(xì)胞對(duì)燦爛弧菌(vibrosplendidus)的吞噬。本論文研究的c型凝集素能作為模式識(shí)別蛋白識(shí)別并結(jié)合pamps及微生物,能凝集微生物并抑制微生物的生長,還能作為調(diào)理素促進(jìn)血淋巴細(xì)胞對(duì)微生物的吞噬作用,在雙殼類動(dòng)物免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。研究成果為深入了解雙殼類免疫識(shí)別分子的結(jié)構(gòu)與功能,闡明軟體動(dòng)物的免疫防御機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳月;余新沛;劉瑩;陳政良;;MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)作用[J];免疫學(xué)雜志;2006年04期

2 王凡平;王明永;楊建斌;趙東方;王紅坡;邵峰;孫瑞利;郭慶合;凌明智;趙永新;宋士軍;郭繼強(qiáng);;甘露聚糖結(jié)合凝集素誘導(dǎo)DC成熟機(jī)制分析[J];中國免疫學(xué)雜志;2012年12期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號(hào)：1165371