本文關鍵詞：中華絨螯蟹組蛋白基因的克隆及其在精子發(fā)生中的變化特征

  更多相關文章： 中華絨螯蟹 精子發(fā)生 組蛋白 基因克隆 免疫熒光 免疫電鏡 非濃縮核

【摘要】：在大多數(shù)動物的精子發(fā)生過程中,與DNA結合的堿性蛋白會逐漸發(fā)生變化,體細胞的組蛋白會被一種過渡蛋白替代,隨后被堿性更強的魚精蛋白替代,隨著替代的蛋白堿性越來越強,精子核被一步步濃縮成了致密的結構。中華絨螯蟹,又稱毛蟹、河蟹,在分類地位上隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、方蟹科、絨螯蟹屬。此類動物的精子無鞭毛,由一個呈酒杯狀的細胞核包裹著一個球形的頂體構成。一個有趣的現(xiàn)象是此類動物的精子核缺少致密的染色質,其精子為非濃縮核,但是其形成機制尚不是很清楚。為了研究組蛋白在中華絨螯蟹精子發(fā)生中的變化特征,本文首先通過PCR的方法克隆出四種組蛋白H2A、H2B、H3和H4的編碼區(qū)基因,其中H2B的編碼區(qū)長369 bp,編碼123個氨基酸,預測分子量大小為13.6 Ku,H2A的編碼區(qū)包含369 bp的堿基,編碼123個氨基酸,預測分子量為13.1 Ku,H3的編碼區(qū)包含408 bp的堿基,編碼136個氨基酸,預測分子量為15.3 Ku,H4的編碼區(qū)為309 bp,編碼103個氨基酸,預測分子量為11.3 ku。隨后構建了相應的原核表達載體p ET-30a-H2B、p ET-30a-H2A、p ET-30a-H3和p ET-30a-H4,之后分別轉化大腸桿(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中,經過異丙基β-D硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導成功表達出相應的重組蛋白;利用NIA-瓊脂糖凝膠柱來純化重組蛋白,免疫新西蘭大白兔(Oryctolagus cuniculus),制備了H2A和H2B的多克隆抗體。其次,通過免疫熒光和免疫電鏡技術來檢測四種組蛋白H2B、H2A、H3和H4在中華絨螯蟹精子發(fā)生中的變化,得到以下實驗結果:1.組蛋白H2B在精原細胞、精母細胞、早期精細胞及其變態(tài)中期精細胞的核內一直存在,在精細胞變態(tài)晚期,組蛋白H2B有一部分從細胞核轉移到了頂體囊中。在成熟的精子中,組蛋白H2B主要存在于頂體囊中。2.組蛋白H3在中華絨螯蟹的整個精子發(fā)生過程中一直存在于生殖細胞包括成熟精子的核內,并沒有發(fā)生拋棄和轉移。3.組蛋白H4在精原細胞、精母細胞、精細胞及其變態(tài)中的精細胞和成熟的精子的核內一直存在,沒有發(fā)生向核外或者頂體囊的轉移。4.組蛋白H2A在精原細胞、精母細胞、精細胞的細胞核和細胞質中存在,在成熟的精子中,主要存在于頂體囊和核杯內側。通過以上的實驗結果,我們推測中華絨螯蟹成熟精子核內組蛋白H3和H4的保留以及精子形成過程中H2B和H2A向頂體囊的轉移與其非濃縮核有一定的關系。
【關鍵詞】：中華絨螯蟹 精子發(fā)生 組蛋白 基因克隆 免疫熒光 免疫電鏡 非濃縮核
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-13
• 第1章 緒論13-24
• 1.1 精子發(fā)生及與其相關的核堿性蛋白13-18
• 1.1.1 精子發(fā)生13-14
• 1.1.2 十足目甲殼動物的精子發(fā)生14
• 1.1.3 精子核堿性蛋白及其在精子發(fā)生中的替代14-18
• 1.1.4 精子核堿性蛋白的修飾在精子核形成中的作用18
• 1.2 十足目非濃縮核的精子核及其堿性蛋白18-20
• 1.3 中華絨螯蟹的雄性生殖系統(tǒng)20-23
• 1.4 研究目的及意義23-24
• 第2章 實驗材料和方法24-37
• 2.1 實驗材料24
• 2.2 主要實驗儀器24-25
• 2.3 主要實驗藥品及配方25-28
• 2.4 試驗技術28-37
• 2.4.1 RNA提取及反轉錄反應28-29
• 2.4.2 基因組DNA的提取29
• 2.4.3 RNA的反轉錄29-30
• 2.4.4 常規(guī)PCR反應30
• 2.4.5 目的片段的回收30-31
• 2.4.6 TA克隆及測序31
• 2.4.7菌種的保存31
• 2.4.8 質粒的提取31-32
• 2.4.9 目的基因與表達載體p ET-30a的連接32
• 2.4.10目的基因的表達32
• 2.4.11鎳柱純化融合蛋白32-33
• 2.4.12多克隆抗體的制備33
• 2.4.13 Western blot檢測抗體33-34
• 2.4.14石蠟切片34
• 2.4.15免疫熒光34-35
• 2.4.16免疫電鏡35-37
• 第3章 中華絨螯蟹組蛋白H2B、H2A、H3和H4的基因克隆、原核表達及抗體制備2537-74
• 3.1 組蛋白H2B的基因克隆，，原核表達及抗體制備37-46
• 3.1.1 方法與步驟37-38
• 3.1.2 實驗結果38-46
• 3.2 組蛋白H2A的基因克隆，原核表達及抗體制備46-54
• 3.2.1 方法與步驟46-47
• 3.2.2 實驗結果47-54
• 3.3 組蛋白H3的基因克隆及原核表達54-61
• 3.3.1 方法與步驟54-55
• 3.3.2 實驗結果55-61
• 3.4 組蛋白H4的基因的克隆及原核表達61-68
• 3.4.1 方法與步驟61-62
• 3.4.2 實驗結果62-68
• 3.5 討論68-74
• 3.5.1 組蛋白基因的克隆68-69
• 3.5.2 原核表達載體的構建69-71
• 3.5.3 重組蛋白的表達71
• 3.5.4 重組蛋白的純化71-72
• 3.5.5 多克隆抗體的制備72
• 3.5.6 Western blot分析72-74
• 第4章 中華絨螯蟹四種組蛋白H2B、H2A、H3和H4在精子發(fā)生中的變化74-97
• 4.1 精巢的組織切片74-78
• 4.1.1 方法與步驟74
• 4.1.2 實驗結果74-78
• 4.2 組蛋白H3和H4在精子發(fā)生中的變化特征78-89
• 4.2.1 方法與步驟78
• 4.2.2 實驗結果78-89
• 4.3 組蛋白H2B在精子發(fā)生中的變化特征89-91
• 4.3.1 方法與步驟89
• 4.3.2 實驗結果89-91
• 4.4 組蛋白H2A在精子發(fā)生中的變化特征91-93
• 4.4.1 方法與步驟91
• 4.4.2 實驗結果91-93
• 4.5 討論93-97
• 4.5.1 堿性蛋白在十足目動物精子發(fā)生中的變化特征93-94
• 4.5.2 中華絨螯蟹精子非濃縮核的初步分析94-96
• 4.5.3 存在問題和展望96-97
• 結論97-98
• 參考文獻98-110
• 致謝110-111
• 攻讀博士期間取得的科研成果111-11

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