本文關(guān)鍵詞：L-肉堿對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的兩種魚細(xì)胞抗氧化功能影響及其機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： L-肉堿 H2O2 氧化應(yīng)激 抗氧化 魚細(xì)胞

【摘要】：活性氧(ROS)是一類具有強(qiáng)氧化力的含氧分子、離子和自由基。氧化應(yīng)激是指ROS過多積累,不能被動(dòng)物機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)及時(shí)清除,導(dǎo)致機(jī)體氧化還原不平衡的狀態(tài)。氧化應(yīng)激不僅危害人類健康還給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。L-肉堿(LC)作為營(yíng)養(yǎng)添加劑,雖然其抗氧化作用在哺乳動(dòng)物上已初步展開研究,但對(duì)魚類抗氧化功能的影響卻鮮有報(bào)道,其抗氧化機(jī)制也尚未明確。因此,本研究擬定在體外條件下,以對(duì)氧化應(yīng)激敏感的肌肉和卵巢組織為研究對(duì)象,即胖頭渆肌肉細(xì)胞系(fathead minnow muscle cell line,FHM)和草魚卵巢細(xì)胞系(Ctenopharyngodon idellus ovary cell line,GCO),以常用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑H2O2建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,采用流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù),逐步研究L-肉堿對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的生長(zhǎng)狀態(tài)、ROS及凋亡水平、抗氧化能力及抗氧化酶mRNA相對(duì)表達(dá)量影響,進(jìn)一步研究L-肉堿對(duì)控制抗氧化酶基因表達(dá)的信號(hào)通路Keap1-Nrf2-ARE的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)節(jié)作用,從而證明L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞抗氧化功能的促進(jìn)作用。本研究為L(zhǎng)-肉堿抗氧化作用機(jī)理的揭示及作為抗氧化劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ),及L-肉堿作為藥物預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生提供理論參考。本研究共包括五部分試驗(yàn),結(jié)果如下:(1)采用細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率兩個(gè)指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn),以MTT法測(cè)定細(xì)胞活力和臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率,檢測(cè)H2O2對(duì)FHM和GCO兩種魚細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率的影響,篩選出對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率抑制水平均為50%左右的H2O2刺激濃度及時(shí)間。在此基礎(chǔ)上,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞中ROS及凋亡水平變化,以生物化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞中MDA、GSH水平及SOD、CAT、GPx和γ-GCS活性變化,判斷所篩選H2O2濃度及時(shí)間是否能誘導(dǎo)FHM和GCO細(xì)胞氧化應(yīng)激。結(jié)果顯示,H2O2對(duì)FHM和GCO兩種魚細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率影響呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴效應(yīng),1 mM H2O2刺激FHM 1h使細(xì)胞活力降低為45%,及存活率降低為55%;同樣的,2.5 mM H2O2刺激GCO 1h使細(xì)胞活力降低為60%,及存活率降低為45%。1和2.5 mM H2O2分別顯著增加FHM和GCO細(xì)胞ROS和細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞MDA含量(p0.05),顯著降低細(xì)胞SOD、GPx和γ-GCS活性(p0.05)。通過對(duì)細(xì)胞ROS、細(xì)胞凋亡和主要抗氧化酶檢驗(yàn)后,在本試驗(yàn)條件下,1 mM H2O2刺激FHM 1h,2.5 mM H2O2刺激GCO 1h能分別成功誘導(dǎo)FHM和GCO氧化損傷。(2)0.1-1mml-肉堿作用fhm細(xì)胞6和12h后,細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組(p0.05),0.01-1mml-肉堿顯著提高gco細(xì)胞活力(p0.05)。與h2o2組相比,0.001-1mml-肉堿顯著提高氧化應(yīng)激fhm細(xì)胞活力(p0.05),相似的,0.1-5mml-肉堿顯著提高氧化應(yīng)激gco細(xì)胞活力(p0.05)。0.1-1mml-肉堿顯著降低fhm細(xì)胞ros水平(p0.05),0.5和1l-肉堿顯著降低gco細(xì)胞ros水平(p0.05)。與h2o2組相比,0.5mml-肉堿顯著降低了氧化應(yīng)激fhm和gco細(xì)胞凋亡和壞死(p0.05)。(3)與h2o2組相比,0.1-1mml-肉堿預(yù)處理組均顯著降低了fhm和gco細(xì)胞的mda含量(p0.05);l-肉堿預(yù)處理組fhm總gsh含量均有所升高,其中1mml-肉堿預(yù)處理組總gsh含量達(dá)到顯著水平(p0.05),0.1-1mml-肉堿預(yù)處理均顯著升高gco細(xì)胞總gsh含量(p0.05);與h2o2組相比,l-肉堿預(yù)處理組fhm細(xì)胞總sod活性均有提高,其中0.1mml-肉堿預(yù)處理組總sod活性達(dá)到顯著水平(p0.05),0.5和1mml-肉堿預(yù)處理顯著提高了gco細(xì)胞總sod活性(p0.05);0.5和1mml-肉堿預(yù)處理組fhm細(xì)胞cat活性顯著高于1mmh2o2組(p0.05),0.5mml-肉堿預(yù)處理組gco細(xì)胞cat活性顯著高于2.5mmh2o2組(p0.05);0.1-1mml-肉堿預(yù)處理組fhm細(xì)胞gpx活性顯著高于1mmh2o2組(p0.05),而l-肉堿預(yù)處理對(duì)gco細(xì)胞gpx活性無顯著影響(p0.05);與h2o2組相比,0.1mml-肉堿預(yù)處理顯著升高了fhm細(xì)胞γ-gcs活性(p0.05),0.5和1mml-肉堿預(yù)處理顯著升高了gco細(xì)胞γ-gcs活性(p0.05)。(4)l-肉堿單獨(dú)處理兩種細(xì)胞,cuzn-sodmrna相對(duì)表達(dá)量顯著升高(p0.05),gco細(xì)胞gpx和gclc兩種酶mrna相對(duì)表達(dá)量顯著升高(p0.05),而對(duì)fhm細(xì)胞無顯著影響(p0.05)。h2o2對(duì)fhm(1.0mm)和gco(2.5mm)刺激顯著上調(diào)兩種細(xì)胞cuzn-sodmrna相對(duì)表達(dá)量(p0.05),顯著下調(diào)兩種細(xì)胞gclcmrna相對(duì)表達(dá)量(p0.05),而對(duì)cat和gpx無顯著性影響(p0.05)。在h2o2誘導(dǎo)狀態(tài)下,l-肉堿(0.1-1mm)預(yù)處理顯著提高fhm(6h)和gco(12h)細(xì)胞gclcmrna相對(duì)表達(dá)量(p0.05),0.5mml-肉堿預(yù)處理組gco細(xì)胞cat和gpxmrna相對(duì)表達(dá)量顯著升高(p0.05),l-肉堿預(yù)處理一定程度上調(diào)了fhm細(xì)胞cuzn-sod、cat和gpxmrna相對(duì)表達(dá)量。(5)h2o2組fhm細(xì)胞nrf2mrna相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差別(p0.05);h2o2組gco細(xì)胞nrf2mrna相對(duì)表達(dá)量顯著降低(p0.05)。0.5mml-肉堿在正常和氧化應(yīng)激條件下均能顯著的提高細(xì)胞中nrf2mrna相對(duì)表達(dá)量(p0.05)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果可知,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,l-肉堿能明顯的促進(jìn)細(xì)胞Nrf2的核移位。綜合以上結(jié)果可知,H2O2可以降低FHM和GCO細(xì)胞活力、存活率及抗氧化功能,誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;而適宜濃度的L-肉堿能提高H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞凋亡和ROS的產(chǎn)生、并能明顯的提高細(xì)胞抗氧化功能;同時(shí),適宜濃度的L-肉堿能上調(diào)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞抗氧化酶及核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,促進(jìn)細(xì)胞Nrf2核移位�？傊�,本研究證明,L-肉堿能促進(jìn)FHM和GCO細(xì)胞生長(zhǎng),提高細(xì)胞的抗氧化功能,L-肉堿對(duì)FHM和GCO細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2具有調(diào)節(jié)作用,其抗氧化機(jī)理與Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路相關(guān)。在本試驗(yàn)條件下,L-肉堿添加0.1-1 mM,作用時(shí)間6-12h可有效保護(hù)FHM和GCO細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。
【關(guān)鍵詞】：L-肉堿 H2O2 氧化應(yīng)激 抗氧化 魚細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S963
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-10
• 前言10-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 活性氧與氧化應(yīng)激12-15
• 1.2 抗氧化防御系統(tǒng)15-18
• 1.3 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路18-21
• 1.4 魚類是研究氧化應(yīng)激的理想模型21-24
• 1.5 L-肉堿抗氧化功能的研究進(jìn)展24-30
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容30-98
• 第一章 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立與檢驗(yàn)30-48
• 1.1 材料與方法30-33
• 1.2 結(jié)果33-44
• 1.3 討論44-47
• 1.4 小結(jié)47-48
• 第二章 L-肉堿對(duì)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響48-62
• 2.1 材料與方法48-49
• 2.2 結(jié)果49-58
• 2.3 討論58-61
• 2.4 小結(jié)61-62
• 第三章 L-肉堿對(duì)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響62-76
• 3.1 材料與方法62-63
• 3.2 結(jié)果63-72
• 3.3 討論72-75
• 3.4 小結(jié)75-76
• 第四章 L-肉堿對(duì)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞抗氧化酶mRNA表達(dá)量的影響76-89
• 4.1 材料與方法76-79
• 4.2 結(jié)果79-86
• 4.3 討論86-88
• 4.4 小結(jié)88-89
• 第五章 L-肉堿對(duì)氧化應(yīng)激FHM和GCO細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及其核移位的影響89-98
• 5.1 材料與方法89-91
• 5.2 結(jié)果91-95
• 5.3 討論95-97
• 5.4 小結(jié)97-98
• 結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-116
• 作者簡(jiǎn)介116-117
• 致謝117

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1079973