本文關(guān)鍵詞：薯蕷皂苷抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學(xué)活性及分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的:考察薯蕷皂苷(dioscin)抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學(xué)活性并探討可能的分子作用機(jī)制。方法:(1)在薯蕷皂苷抗肝缺血再灌注損傷(hepatic I/R injure)研究中,采用70%Wistar大鼠肝缺血模型。預(yù)防組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和高中低劑量給藥組(薯蕷皂苷,60、40和20 mg/kg),每組10只,每天口服給予薯蕷皂苷1次,連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和給藥組(薯蕷皂苷,60 mg/kg),每組20只,手術(shù)前2 h口服給予薯蕷皂苷1次,術(shù)后每天給藥一次。檢測血清ALT、AST水平,結(jié)合組織病理學(xué)和生存率等指標(biāo)來評價薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用;測定肝組織中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、GSH、NO、iNOS和TNOS含量來考察薯蕷皂苷的抗氧化能力;采用DAPI、TUNEL和DAB分析法考察薯蕷皂苷的抗凋亡作用;采用免疫組織化學(xué)、western blotting及real-time PCR方法考察薯蕷皂苷對凋亡和炎癥信號通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá)影響。(2)在薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷(cerebral I/R injure)研究中,體外建立PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞的OGD/R模型,薯蕷皂苷(200、100和50 ng/m L)預(yù)處理12 h,用MTT法、LDH、NeuN的釋放測定來評價薯蕷皂苷對OGD/R損傷細(xì)胞的保護(hù)作用;體內(nèi)建立SD大鼠MCAO的腦缺血再灌注模型,預(yù)防組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組(60、40和20 mg/kg),每組10只,每天口服給予薯蕷皂苷1次,連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組(60、40和20 mg/kg),每組10只,建立MCAO模型前2 h口服給予薯蕷皂苷1次,術(shù)后每天給藥一次;以預(yù)防組的神經(jīng)功能缺損評分、大腦ttc染色、大腦相關(guān)指數(shù)、大腦組織ldh釋放水平、組織病理學(xué)、大腦細(xì)胞標(biāo)志物(neun、gfap和kir4.1)測定和tunel檢測,以及治療組的神經(jīng)功能缺損評分和生存率來評價薯蕷皂苷對mcao大鼠的腦保護(hù)作用;采用westernblotting及real-timepcr方法考察薯蕷皂苷對大腦中涉及hmgb-1/tlr4炎癥信號通路相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)影響;并采用hmbg-1、tlr4sirna干擾和全基因過表達(dá)實驗分別驗證薯蕷皂苷是否是通過抑制hmgb-1/tlr4信號通路抗腦缺血再灌注損傷。結(jié)果:(1)在抗肝缺血再灌注損傷實驗中,預(yù)防組實驗發(fā)現(xiàn),與模型組相比,薯蕷皂苷能顯著降低血清alt和ast活性,減輕由肝缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肝組織損傷;治療組實驗發(fā)現(xiàn),與模型組相比,薯蕷皂苷(60mg/kg)能顯著降低不同時間點血清alt和ast酶活性,提高大鼠生存率。同時,薯蕷皂苷可顯著降低mda、inos、tnos、no含量,升高gsh、gsh-px、sod、cat水平,改善氧化應(yīng)激,并能夠減少tunel陽性細(xì)胞數(shù),減輕肝細(xì)胞的凋亡;分子機(jī)制研究表明薯蕷皂苷能夠降低mapks磷酸化水平,下調(diào)cyp2e1、il-1β、il-6、tnf-α、icam-1、mip-1α、mip-2、nf-κb、ap-1、cox-2和hmgb-1等炎癥因子的基因或蛋白表達(dá)水平,降低parp、caspase-9、caspase-3、bak、p53、fas和fasl等凋亡蛋白或基因表達(dá)水平,上調(diào)bcl-2和bcl-x的蛋白表達(dá)水平。(2)在抗腦缺血再灌注損傷的實驗中,體外實驗發(fā)現(xiàn),與ogd/r模型組相比,薯蕷皂苷能顯著升高pc12和原代神經(jīng)元的細(xì)胞活力,減少ldh釋放,增加原代神經(jīng)元的neun釋放;體內(nèi)預(yù)防實驗中,與模型組相比,薯蕷皂苷能顯著改善mcao大鼠的大腦神經(jīng)功能缺損評分、減少ttc染色陽性區(qū)域、大腦ldh釋放水平、大腦相關(guān)指數(shù)以及大腦組織的gfap、kir4.1和tunel陽性細(xì)胞數(shù),增加腦組織neun陽性細(xì)胞數(shù);體內(nèi)治療實驗中,與模型組相比,薯蕷皂苷可以改善mcao大鼠的大腦神經(jīng)功能缺損評分,提高大鼠生存率。分子機(jī)制研究表明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷是通過抑制hmgb-1的核轉(zhuǎn)移,降低hmgb-1蛋白表達(dá)水平,從而抑制tlr4炎癥信號通路的相關(guān)蛋白nf-κb、ap-1、mapks、p-stat3和炎癥因子;進(jìn)一步的hmgb-1、tlr4sirna和全基因過表達(dá)實驗結(jié)果證明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷的作用靶點是hmgb-1/tlr4信號通路。結(jié)論:(1)薯蕷皂苷是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平、抗炎和抗凋亡等途徑來實現(xiàn)抗肝缺血再灌注損傷的生物學(xué)作用;(2)薯蕷皂苷有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用,這種作用是通過抑制HMGB-1/TLR4信號通路來實現(xiàn)的�？傊�,薯蕷皂苷在抗肝腦缺血再灌注損傷方面具有較好的生物學(xué)活性,值得深入探索和研究。
【關(guān)鍵詞】：薯蕷皂苷 肝缺血再灌注損傷 腦缺血再灌注損傷 氧化應(yīng)激 抗凋亡 抗炎
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 前言16-18
• 第一部分：薯蕷皂苷抗肝缺血再灌注損傷的生物學(xué) 活性及分子機(jī)制研究18-33
• 前言18
• 材料和方法18-24
• 1. 材料18-19
• 1.1. 實驗動物18
• 1.2. 試劑和藥品18-19
• 1.3. 儀器19
• 2. 實驗方法19-24
• 2.1. 藥物配制19
• 2.2. 實驗動物分組與處理19-20
• 2.3. 血清和肝生化指標(biāo)測定20
• 2.4. 組織病理學(xué)檢查20
• 2.5. DAPI染色20-21
• 2.6. TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡21
• 2.7. 免疫組織化學(xué)分析21-22
• 2.8. Real-time PCR分析22
• 2.9. Western blotting分析22-24
• 2.10. 統(tǒng)計學(xué)分析24
• 結(jié)果24-31
• 3.1. 薯蕷皂苷預(yù)防給藥對大鼠組織病理學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)的影響24-25
• 3.2. 薯蕷皂苷治療給藥對大鼠血清學(xué)指標(biāo)和生存率的影響25
• 3.3. 薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響25
• 3.4. 薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷大鼠肝細(xì)胞的影響25-27
• 3.5. 薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷大鼠的HMGB-1、PARP、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響27-28
• 3.6. 薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷大鼠炎癥通路中相關(guān)分子表達(dá)的影響28
• 3.7. 薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷大鼠凋亡通路中相關(guān)分子表達(dá)的影響28-29
• 3.8. 薯蕷皂苷對MAPKs相關(guān)分子表達(dá)的影響29-31
• 討論31-32
• 結(jié)論32-33
• 第二部分 薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷的生物學(xué)活性及分子機(jī)制研究33-66
• 前言33
• 材料和方法33-43
• 1. 材料33-35
• 1.1. 細(xì)胞33
• 1.2. 實驗動物33
• 1.3. 試劑和藥品33-34
• 1.4. 儀器34-35
• 2. 實驗方法35-43
• 2.1. 藥物配制35
• 2.2. 細(xì)胞培養(yǎng)35-37
• 2.3. 細(xì)胞毒性測定37
• 2.4. 細(xì)胞OGD/R模型建立37
• 2.5. 細(xì)胞活力分析37-38
• 2.6. 細(xì)胞LDH釋放測定38
• 2.7. 原代神經(jīng)元細(xì)胞Neu N釋放檢測38
• 2.8. 實驗動物分組與處理38-39
• 2.9. 腦梗死體積和大腦相關(guān)指數(shù)的測定39
• 2.10. 大腦組織LDH的測定39
• 2.11. 神經(jīng)功能缺損評分39
• 2.12. 組織病理學(xué)檢查39-40
• 2.13. TUNEL法檢測腦細(xì)胞凋亡40
• 2.14. 免疫組織化學(xué)分析40-41
• 2.15. Real-time PCR分析41
• 2.16. Western blotting分析41
• 2.17. 最佳HMGB-1 和TLR4 siRNA干擾序列選擇41-42
• 2.18. HMGB-1 和TLR4 si RNA轉(zhuǎn)染實驗42-43
• 2.19. HMGB-1 和TLR4過表達(dá)全基因轉(zhuǎn)染實驗43
• 2.20. 統(tǒng)計學(xué)分析43
• 結(jié)果43-63
• 3.1. 薯蕷皂苷對PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞毒性43
• 3.2. 薯蕷皂苷對OGD/R損傷的PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞活力影響43-45
• 3.3. 薯蕷皂苷對OGD/R損傷的PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響45
• 3.4. 薯蕷皂苷預(yù)防給藥對MCAO損傷的大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響45-46
• 3.5. 薯蕷皂苷預(yù)防給藥對腦梗死體積、相關(guān)腦指數(shù)和腦組織LDH的影響46-48
• 3.6. 薯蕷皂苷治療給藥對大鼠神經(jīng)功能及生存率的影響48
• 3.7. 薯蕷皂苷對MCAO大鼠組織病理學(xué)的影響48-49
• 3.8. 薯蕷皂苷對MCAO大鼠炎癥因子的影響49
• 3.9. 薯蕷皂苷對HMGB-1/TLR4信號通路相關(guān)蛋白的影響49-51
• 3.10. 薯蕷皂苷對PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞炎癥因子的影響51
• 3.11. 薯蕷皂苷對PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞MMP-9 和HMGB-1 表達(dá)的影響51-52
• 3.12. 薯蕷皂苷對PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響52
• 3.13. PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞最佳HMGB-1 和TLR4 siRNA的選擇52-53
• 3.14. 薯蕷皂苷對HMGB-1 siRNA神經(jīng)保護(hù)作用的影響53-56
• 3.15. HMGB-1 DNA逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用56-57
• 3.16. 薯蕷皂苷對TLR4 si RNA神經(jīng)保護(hù)作用的影響57-60
• 3.17. TLR4 DNA逆轉(zhuǎn)薯蕷皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用60-63
• 討論63-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 綜述74-96
• 參考文獻(xiàn)86-96
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況96-97
• 附錄97-99
• 致謝99-100

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本文編號：885687