本文關(guān)鍵詞：SMYD3對(duì)雌激素代謝酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用機(jī)制分析

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【摘要】：組蛋白甲基化酶SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3)是乳腺癌等癌癥中的重要調(diào)控因子,而雌激素信號(hào)通路的異�；钴S以及雌激素代謝產(chǎn)物亦與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而,關(guān)于SMYD3在雌激素代謝中的作用,迄今為止尚未見有相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本論文圍繞SMYD3對(duì)CYP1A1、CYP1B1兩種雌激素Ⅰ相代謝酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用機(jī)制,加以較為系統(tǒng)的研究,以期為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)防治療、合理用藥及新藥研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。本文首先用不同濃度的17β-雌二醇(E2)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行處理,RT-PCR、Western blot分析發(fā)現(xiàn)CYP1A1、CYP1B1的表達(dá)量均可隨E2濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性的上調(diào)。在采用RNA干擾特異性抑制內(nèi)源性SMYD3表達(dá)后,CYP1A1、 CYP1B1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均進(jìn)一步顯著上升,同時(shí)高效液相色譜(HPLC)分析也證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中E2的殘留量隨之減少,而細(xì)胞內(nèi)E2代謝產(chǎn)物20H-E2及40H-E2的產(chǎn)生量一則相應(yīng)增多。此外,Real time RT-PCR及免疫組織化學(xué)分析表明SMYD3在乳腺癌細(xì)..胞及組織中的表達(dá)量均明顯高于正常乳腺細(xì)胞及癌旁組織,而CYP1A1、CYP1B1 的表達(dá)水平則與SMYD3的表達(dá)量呈明顯的負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明：SMYD3可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中CYP1A1、CYP1B1的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并因此抑制雌激素的Ⅰ相代謝反應(yīng)。接下來,通過對(duì)CYP1A1、CYP1B1啟動(dòng)子區(qū)域序列分析,發(fā)現(xiàn)二者均含有多個(gè)SMYD3結(jié)合位點(diǎn)(SBE)。熒光素酶報(bào)告分析及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SMYD3可與CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)-281位的SBE及CYP1B1啟動(dòng)子區(qū)-21位的SBE.結(jié)合,增強(qiáng)該區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化修飾水平。將甲基化功能缺失的SMYD3突變體(SMYD3ANHS E)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中后,Real time RT-PCR分析顯示SMYD3對(duì)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄抑制作用基本解除,而對(duì)CYP1B1的轉(zhuǎn)錄抑制作用則部分解除。表明SMYD3對(duì)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄抑制作用主要是通過催化CYP1A1啟動(dòng)子-281位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20發(fā)生甲基化而產(chǎn)生的,而其對(duì)CYP1B1的轉(zhuǎn)錄抑制除了催化CYP1B1啟動(dòng)子區(qū)-21位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化外,還存在其它機(jī)制。結(jié)合本課題組前期的miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果及生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)在CYP1B1的3’UTR中存在有SMYD3下游靶基因miR-200c的結(jié)合位點(diǎn)(MRE),利用熒光素酶報(bào)告分析、RT-PCR、Western blot等實(shí)驗(yàn),研究證實(shí)miR-200c可通過與CYP1B1 3'UTR的結(jié)合抑制其翻譯過程。不僅如此,伴隨著E2濃度的降低,MCF-7細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著的增加,而CYP1B1則呈現(xiàn)出明顯的下調(diào),二者具有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明SMYD3的下游靶基因miR-200c也是CYP1B1的重要負(fù)調(diào)控因子,其在E2及SMYD3對(duì)CYP1B1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 SMYD3 CYP1A1 CYP1B1 雌激素 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-17
• 1.1 雌激素及其代謝產(chǎn)物在乳腺癌中的作用9-11
• 1.1.1 雌激素9
• 1.1.2 雌二醇與乳腺癌的關(guān)系9-10
• 1.1.3 CYP1A1、CYP1B1介導(dǎo)的雌二醇代謝及其與乳腺癌的關(guān)系10-11
• 1.2 組蛋白甲基化與組蛋白甲基化酶SMYD311-14
• 1.2.1 表觀遺傳及組蛋白甲基化概述11
• 1.2.2 SMYD3的基本特征11-12
• 1.2.3 SMYD3的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用機(jī)制12-13
• 1.2.4 SMYD3在乳腺癌中的作用13-14
• 1.3 miR-200c與乳腺癌的關(guān)系14-15
• 1.3.1 microRNAs的機(jī)制概述14-15
• 1.3.2 miR-200家族概述及其與乳腺癌的關(guān)系15
• 1.4 本課題的主要內(nèi)容、研究目的及意義15-17
• 2 材料與方法17-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-26
• 2.1.1 材料與試劑17-19
• 2.1.2 常用溶液及培養(yǎng)基配制方法19-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-46
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)26-27
• 2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染27-28
• 2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)28-33
• 2.2.4 蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)33-34
• 2.2.5 熒光素酶活性檢測(cè)(Luciferase reporter assay)34-35
• 2.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)35-37
• 2.2.7 免疫熒光技術(shù)及免疫組織化學(xué)37-38
• 2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備38
• 2.2.9 CYP1B1 YUTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建38-43
• 2.2.10 點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建43-45
• 2.2.11 雌激素及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析(HPLC)45
• 2.2.12 統(tǒng)計(jì)分析方法45-46
• 3 結(jié)果與討論46-66
• 3.1 E_2及SMYD3對(duì)雌激素代謝酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析46-49
• 3.1.1 E_2對(duì)乳腺癌細(xì)胞中CYP1A1、CYP1B1和COMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析46
• 3.1.2 SMYD3對(duì)CYP1A1、CYP1B1和COMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析46-49
• 3.2 乳腺癌細(xì)胞及臨床組織樣本中的表達(dá)相關(guān)性分析49-50
• 3.2.1 SMYD3與CYP1A1、CYP1B1在乳腺細(xì)胞中及相關(guān)性分析49
• 3.2.2 臨床乳腺癌組織樣本中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析49-50
• 3.3 SMYD3對(duì)雌激素代謝影響情況的HPLC分析50-52
• 3.3.1 SMYD3對(duì)MCF-7細(xì)胞外E_2代謝消耗的影響情況分析50-51
• 3.3.2 SMYD3對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)2-OHE_2和4-OHE_2生成量的影響情況分析51-52
• 3.4 SMYD3對(duì)CYP1A1、CYP1B1轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用機(jī)制分析52-59
• 3.4.1 SMYD3對(duì)CYP1A1、CYP1B1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析52-57
• 3.4.2 組蛋白甲基化在SMYD3對(duì)CYP1A1、CYP1B1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用57-59
• 3.5 miR-200c在SMYD3抑制CYP1B1轉(zhuǎn)錄中的作用分析59-64
• 3.5.1 miR-200c對(duì)CYP1B1的3'UTR轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析59-63
• 3.5.2 miR-200c對(duì)CYP1B1 mRNA及蛋白質(zhì)水平的影響情況分析63-64
• 3.5.3 E_2對(duì)miR-200c轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用分析64
• 3.6 SMYD3對(duì)雌激素代謝酶CYP1A1、CYP1B1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制小結(jié)64-66
• 4 結(jié)論66-67
• 5 展望67-68
• 6 參考文獻(xiàn)68-75
• 7 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況75-76
• 8 致謝76

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