本文關(guān)鍵詞：高血壓心肌重構(gòu)中泛素活化酶的抑制對心肌肥厚的影響和治療研究

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【摘要】：背景和目的:高血壓所致的心肌重構(gòu)以心臟負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌肥厚為主要表現(xiàn)之一。繼發(fā)性心肌肥厚也主要發(fā)生在高血壓性心肌病,肺動脈高壓和慢性充血性心力衰竭中,而心肌肥厚又明顯增加心律失常、心衰、及猝死率。心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,目前的藥物對抗心肌肥厚的作用欠佳,探索抑制心肌肥厚甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的新機(jī)制和治療藥物,是全世界醫(yī)療工作者面臨的重要課題和研究方向。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)廣泛存在于心肌組織中負(fù)責(zé)參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解從而影響心肌重構(gòu)的過程,已有研究表明部分抑制泛素蛋白酶體活性可以抑制體外心肌細(xì)胞的肥厚,因此我們假設(shè)抑制處于UPS系統(tǒng)起始位點(diǎn)的關(guān)鍵泛素活化酶(UBA1、E1)可能具有更強(qiáng)大的抑制心肌肥厚的作用,本課題的研究目的是明確高血壓所致心肌重構(gòu)過程中泛素活化酶E1的變化,以及明確抑制E1活性能否抑制體內(nèi)、體外試驗(yàn)中血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌肥厚,為臨床治療心肌肥厚提供新的研究靶點(diǎn)和治療藥物。方法:臨床資料:臨床心臟瓣膜病患者,開胸接受瓣膜置換手術(shù)切取的心耳組織,石蠟切片行免疫組化染色檢測泛素活化酶E1在人體心臟組織的表達(dá)情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):選取C57BL/6品系周齡6-8周雄性小鼠,將其隨機(jī)分入6組:對照組、血管緊張素II(AngII)埋泵組、E1抑制劑對照組(PYR-41 5mg/kg)、E1抑制劑對照組(PYR-41 10mg/kg)、血管緊張素II埋泵+E1抑制劑治療組(PYR-41 5mg/kg)、血管緊張素II埋泵+E1抑制劑治療組(PYR-41 10mg/kg)。AngII(體內(nèi)灌注1000ng/kg/min)埋泵建立高血壓心肌肥厚以及抑制劑注射治療心肌肥厚2周后,采用動物心臟超聲檢測小鼠心肌肥厚及心功能情況、熒光麥胚凝集素(wga)染色觀察小鼠心臟組織心肌細(xì)胞肥厚及治療情況。體外實(shí)驗(yàn):選取sd大鼠出生24小時以內(nèi)的雄性乳鼠,提取乳鼠心肌原代細(xì)胞(nrcs)培養(yǎng),將細(xì)胞隨機(jī)分組培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿分8組:對照組、angii組(100nm)、e1抑制劑對照組(5um)、e1抑制劑對照組(10um),angii+e1抑制劑治療組(5um),angii+e1抑制劑治療組(10um),苯腎上腺素(phenylephrine,pe)組、pe+e1抑制劑治療組(5um),pe+e1抑制劑治療組(10um)。藥物刺激24小時后,對各組心肌進(jìn)行免疫熒光染色測定細(xì)胞肥大情況、提取細(xì)胞總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(westernblot)觀察泛素活化酶(e1)表達(dá)水平的改變。提取組織總蛋白行westernblot觀察細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶erk表達(dá)水平的改變。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用graphpadprism和spss軟件利用kruskalwallis、onewayanova方法檢測各組數(shù)據(jù)差異性。結(jié)果:1.人體心臟組織中泛素活化酶e1廣泛存在,e1也廣泛存在于鼠心肌細(xì)胞中。2.angii誘導(dǎo)的小鼠高血壓心肌肥厚3天、7天、14天后,與對照組相比,小鼠心臟組織中泛素活化酶e1表達(dá)顯著增高,p0.05。體外angii分別以25nm、50nm、100nm濃度刺激乳鼠心肌細(xì)胞,與對照組相比,50nm、100nm濃度刺激組e1表達(dá)顯著增高(p0.05)。3.angii刺激血壓升高引起心肌肥厚,與對照組相比,小鼠心重體重比增大、心臟前后壁厚度增厚,左室射血分?jǐn)?shù)與短軸縮短率下降(p0.05)。angii+e1抑制劑治療組小鼠心重比未見明顯增大、心臟前后壁未見明顯肥厚,左室射血分?jǐn)?shù)與短軸縮短率與對照組相比未見明顯差異(p0.05)。4.angii泵植入小鼠體內(nèi)1周后,與對照組相比,angii組動脈收縮壓顯著升高(p0.05),angii+e1抑制劑治療組血壓顯著升高(p0.05),對照組與單純抑制劑對照組相比血壓無差異(p0.05)。5.angii與pe刺激體外心肌細(xì)胞肥大,使細(xì)胞體積肥大近對照組2倍。與肥大組相比,e1抑制劑在5um和10um濃度下均能顯著抑制心肌細(xì)胞肥大(p0.05)。6.angii可引起小鼠體內(nèi)胞外信號調(diào)節(jié)激酶erk磷酸化表達(dá)升高,e1抑制劑可顯著抑制磷酸化erk的表達(dá)從而抑制心肌肥厚相關(guān)的信號通路。結(jié)論:1.血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚過程中,泛素活化酶E1的表達(dá)顯著進(jìn)行性增高。血管緊張素II的刺激劑量與E1的表達(dá)增高呈正相關(guān)。2.E1特異性抑制劑PYR-41可以抑制高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚,同時具有保護(hù)心臟功能的作用。E1抑制劑可以抑制體外血管緊張素II、苯腎上腺素引起的心肌細(xì)胞肥大。3.血管緊張素II引起的高血壓不能被E1抑制劑降壓,E1抑制劑治療心肌肥厚不是通過降低血壓的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。4.E1抑制劑通過抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK磷酸化(p-ERK)是其抑制心肌肥厚的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：高血壓 心肌肥厚 血管緊張素 II 泛素活化酶 E1 胞外信號調(diào)節(jié)激酶
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1;R542.2
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 材料16-18
• 一、實(shí)驗(yàn)對象16
• 二、實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 1、主要抗體16
• 2、主要試劑16-17
• 3、實(shí)驗(yàn)設(shè)備17-18
• 方法18-25
• 1. 臨床人體心臟組織樣本的獲取與保存18
• 2. AngII誘發(fā)的體內(nèi)高血壓心肌肥厚實(shí)驗(yàn)18-19
• 3. 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)19
• 4. 體外心肌細(xì)胞肥大模型及抑制試驗(yàn)19-20
• 5. 動脈血壓測定：無創(chuàng)傷尾套法20
• 6. 藥物注射20
• 7. 超聲心動圖檢測20
• 8. 心臟組織取材及病理切片20-21
• 9. 免疫組化染色21
• 10. WGA染色21-22
• 11. 細(xì)胞免疫熒光染色22
• 12. 蛋白質(zhì)提取22-23
• 13. Western Blot23-25
• 結(jié)果25-32
• 1. 人體心肌組織和大鼠心肌細(xì)胞中泛素活化酶廣泛存在25-26
• 2. AngII誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚過程中泛素活化酶顯著增高26-27
• 3. AngII誘導(dǎo)高血壓所致心肌肥大可被泛素活化酶抑制劑抑制27-31
• 3.1 AngII顯著升高血壓，泛素活化酶抑制劑不具有降壓作用27
• 3.2 體內(nèi)AngII誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚可被泛素活化酶抑制劑抑制27-30
• 3.3 體外AngII、PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大可被泛素活化酶抑制劑抑制30-31
• 4. 泛素活化酶抑制劑參與抑制ERK信號通路31-32
• 討論32-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 綜述42-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章54-55
• 致謝55-56

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本文編號：805984