本文關(guān)鍵詞：miR-200b對乳腺癌細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響及機制研究

  更多相關(guān)文章： 乳腺癌 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4(FUT4) miR-200b PI3K/Akt

【摘要】：目的:microRNAs作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,可參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。miR-200b是miR-200家族的成員之一,在惡性程度高的乳腺癌細(xì)胞中低表達,在惡性程度低的乳腺癌細(xì)胞中高表達。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4(FUT4)是編碼糖復(fù)合物糖鏈巖藻糖化的酶蛋白,催化L-fucose從GDP-fucose轉(zhuǎn)移至相應(yīng)受體上形成α-1,3糖苷鍵。FUT4在乳腺癌細(xì)胞中高表達,促進乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT,和乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。本研究將探討miR-200b與FUT4的關(guān)系,探討其是否靶向FUT4并是否通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的增殖,遷移和侵襲功能,探討miR-200b能否成為乳腺癌診斷和治療的新靶點。方法:1.miR-200b,FUT4在乳腺癌中的表達(1)采用實時熒光定量PCR技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測乳腺癌組織中miR-200b,FUT4的表達。(2)將miR-200b模擬物(miR-200b mimics)轉(zhuǎn)染進入乳腺癌細(xì)胞MCF-7中,利用實時熒光定量PCR技術(shù),Western blot,細(xì)胞免疫熒光實驗檢測miR-200b,FUT4的表達變化。2.miR-200b對FUT4的靶向調(diào)節(jié)作用(1)利用TargetScan,PicTar等軟件預(yù)測miR-200b與FUT4的結(jié)合位點,初步預(yù)測FUT4是否為miR-200b的候選靶基因。(2)將miR-200b mimics轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7中,增加miR-200b的表達水平,并利用實時熒光定量PCR檢測miR-200b,FUT4的表達變化,Western blot檢測FUT4在蛋白水平的變化。(3)構(gòu)建fut43’-非翻譯區(qū)(3’-utr)的psi-check-2載體(psi-check-2-fut4-3’utr),與mir-200bmimics共同轉(zhuǎn)染進入mcf-7細(xì)胞內(nèi),采用雙熒光素酶基因報告實驗檢測fut4熒光素酶活性的變化。3.mir-200b對乳腺癌細(xì)胞mcf-7增殖,遷移和侵襲功能的影響(1)將mir-200bmimics轉(zhuǎn)染入mcf-7細(xì)胞內(nèi),通過cck-8實驗以及平板克隆形成實驗檢測mir-200b對細(xì)胞增殖能力的影響。(2)將mir-200bmimics轉(zhuǎn)染入mcf-7細(xì)胞內(nèi),采用細(xì)胞劃痕實驗檢測mir-200b對細(xì)胞遷移能力的影響。(3)將mir-200bmimics轉(zhuǎn)染入mcf-7細(xì)胞內(nèi),利用transwell體外細(xì)胞侵襲實驗檢測mir-200b對細(xì)胞侵襲能力的影響。4.mir-200b通過調(diào)節(jié)fut4的表達對pi3k/akt信號通路的影響轉(zhuǎn)染mir-200bmimics進入mcf-7細(xì)胞后,通過westernblot檢測細(xì)胞內(nèi)fut4及pi3k/akt信號通路中相關(guān)分子的變化。結(jié)果:1.上調(diào)mcf-7細(xì)胞中mir-200b的表達導(dǎo)致fut4表達下降采用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染mir-200bmimics進入mcf-7細(xì)胞,實時熒光定量pcr結(jié)果發(fā)現(xiàn)mcf-7細(xì)胞中mir-200b表達增加,fut4表達降低;westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)fut4在蛋白水平表達降低;細(xì)胞免疫熒光實驗結(jié)果也表明轉(zhuǎn)染mir-200bmimics后,fut4在蛋白水平表達下調(diào)。2.fut4是mir-200b的靶基因通過軟件預(yù)測,fut4有可能成為mir-200b的候選靶基因,兩者之間存在互補結(jié)合位點,將構(gòu)建的含有fut43’-非翻譯區(qū)的psi-check-2-fut4-3’utr與mir-200bmimics共同轉(zhuǎn)染進入mcf-7細(xì)胞內(nèi),通過雙熒光素酶基因報告實驗發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染scramblemimics的對照組比較,mir-200b抑制了轉(zhuǎn)染報告基因的mcf-7細(xì)胞中fut4的熒光素酶活性,表明fut4是mir-200b的靶基因。3.mir-200b對mcf-7細(xì)胞增殖,遷移和侵襲功能的影響(1)cck-8細(xì)胞增殖實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,上調(diào)mcf-7細(xì)胞內(nèi)mir-200b的表達水平,與對照組相比,該組細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力減弱。(2)細(xì)胞劃痕實驗表明,轉(zhuǎn)染mir-200bmimics后,mcf-7細(xì)胞的遷移能力與對照組相比減弱。(3)Transwell體外細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明,MCF-7細(xì)胞中miR-200b表達上調(diào)后,細(xì)胞的侵襲能力與對照組相比減弱。4.miR-200b通過調(diào)節(jié)FUT4的表達對PI3K/Akt信號通路的影響上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-200b的表達水平后,發(fā)現(xiàn)FUT4的表達下降,PI3K/Akt信號通路中p-PI3K、p-PDK、p-Akt(ser473)分子的表達均下調(diào),與miR-200b表達增強后細(xì)胞增殖,遷移和侵襲能力減弱相一致。結(jié)論:1.通過雙熒光素酶基因報告實驗表明FUT4是mi R-200b的靶基因。2.上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-200b的表達水平,細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力減弱,表明miR-200b可影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲功能。3.在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中,miR-200b可以調(diào)節(jié)FUT4的表達水平,并可能通過PI3K/Akt信號通路影響細(xì)胞增殖,遷移和侵襲功能。4.miR-200b通過調(diào)節(jié)FUT4的表達而影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖,遷移和侵襲等生物學(xué)行為,可能成為乳腺癌診斷、治療的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4(FUT4) miR-200b PI3K/Akt
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-27
• 1. 材料15-18
• 1.1 實驗材料15-17
• 1.2 實驗試劑17-18
• 2. 實驗儀器18-19
• 3. 實驗方法19-27
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 3.2 RNA提取20
• 3.3 Real-time PCR20-22
• 3.4 免疫組織化學(xué)染色22
• 3.5 細(xì)胞增殖實驗22-23
• 3.6 細(xì)胞免疫熒光23-24
• 3.7 細(xì)胞劃痕實驗24
• 3.8 Transwell細(xì)胞體外侵襲驗24-25
• 3.9 雙熒光素酶基因報告實驗25
• 3.10 細(xì)胞總蛋白的提取25-26
• 3.11 比色法測定蛋白濃度26
• 3.12 免疫印跡分析26-27
• 3.13 統(tǒng)計學(xué)分析27
• 結(jié)果27-34
• 1. miR-200b，，F(xiàn)UT4在乳腺癌組織中的表達27-28
• 2. miR-200b與FUT4具有互補結(jié)合位點28-29
• 3. miR-200b對FUT4有靶向調(diào)節(jié)作用29
• 4.上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中mi R-200b的表達導(dǎo)致FUT4的表達下降29-30
• 5.上調(diào)miR-200b的表達對MCF-7 細(xì)胞增殖，遷移和侵襲功能的影響30-32
• 6.miR-200b靶向FUT4并可能通過PI3K/Akt信號通路影響細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲32-34
• 討論34-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-47
• 綜述47-61
• 參考文獻56-61
• 致謝61-62

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