本文關鍵詞：角蛋白8參與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管上皮細胞凋亡、線粒體損傷及其信號傳導機制

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【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一種以肝內中小膽管進行性破壞為特征的自身免疫性膽汁淤積性肝臟疾病。約90%-95%的PBC患者可檢測到抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibodies,AMA),線粒體何種成分失去免疫耐受引起PBC發(fā)病并不清楚。細胞凋亡時細胞膜損傷、卷曲以及外翻使細胞內容物外漏,線粒體成分降解清除障礙,產生免疫原性片段可能誘發(fā)了PBC。角蛋白(Cytokeratin,CK)是細胞骨架蛋白中間絲家族中數量最多和最重要的成員,不僅具有保護細胞、維持線粒體正常結構的功能,而且參與細胞生長、凋亡等重要生理病理過程。角蛋白缺失或異常表達與疾病密切相關。研究表明,過表達CK8會引發(fā)小鼠慢性胰腺炎;CK8-/-的小鼠會發(fā)生自發(fā)性結腸炎;乳腺癌中CK8的表達明顯上調。近年來,有學者認為CK8缺失或表達異常同肝臟疾病發(fā)病相關。研究發(fā)現,小鼠肝臟損傷時,CK8以及CK18 m RNA和蛋白的表達量可升高3倍[8,29]。CK8-/-小鼠可出現慢性肝炎,肝細胞損傷、凋亡[30],C57/B1 CK8-/-小鼠約94%胚胎期死亡并伴廣泛肝出血、肝損傷[31],FVB/N CK8-/-小鼠55%有正常的生存期,但在基礎狀態(tài)時表現為輕微肝炎、肝巨噬細胞異常和肝細胞增生,予膠原酶灌注后出現明顯肝壞死,對凋亡誘導劑的敏感性明顯增加[9]。另外有研究報道,CK8表達異常可能同PBC發(fā)病相關。PBC患者體內可檢測到抗CK8自身抗體,PBC患者肝臟CK8/CK18的蛋白含量可升高2-4倍。國外研究也證實在PBC患者中CK8突變明顯升高,CK8缺失或表達異常與PBC的嚴重程度相關。動物實驗亦發(fā)現CK8-/-小鼠肝細胞線粒體形態(tài)、功能發(fā)生變化,且血清抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibodies,AMA)陽性。以上研究提示:CK8缺失或異常表達可能參與PBC的發(fā)病,但是,CK8缺失或表達異常在PBC發(fā)病中扮演的角色并不清楚。本研究探討CK8是否通過影響線粒體功能誘導細胞凋亡參與PBC發(fā)病。【目的】1、研究過表達以及干擾CK8對人膽管細胞RBE凋亡的影響;2、研究過表達以及干擾CK8對人膽管細胞RBE線粒體形態(tài)和功能的影響;3、探討CK8表達異常通過何種信號通路介導細胞凋亡�！痉椒ā�1、構建CK8過表達以及干擾慢病毒載體,感染人膽管細胞RBE,建立CK8過表達以及干擾細胞系,采用RT-PCR和Western Blot檢測人膽管細胞RBE中CK8的表達量;2、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析過表達以及干擾CK8人膽管細胞RBE凋亡水平變化;3、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析過表達以及干擾CK8人膽管細胞RBE線粒體的形態(tài)和功能的變化;4、通過Western Blot實驗研究AKT信號通路在過表達以及干擾CK8凋亡中作用;5、采用免疫細胞化學實驗和流式細胞術分析GCDC作用對人膽管細胞RBE凋亡的影響;6、采用免疫細胞化學和流式細胞術分析GCDC作用對線粒體的形態(tài)和功能的變化;7、通過Western Blot實驗研究AKT信號通路在GCDC作用后CK8表達異常的人膽管細胞RBE凋亡中作用;【結果】1、CK8表達異常促進人膽管細胞RBE凋亡RT-PCR和Western Blot實驗結果顯示,過表達以及干擾CK8細胞角蛋白量發(fā)生相應改變。激光共聚焦實驗結果顯示,過表達以及干擾CK8細胞角蛋白成團狀、且分布不均,細胞核固縮、碎裂。流式細胞術實驗結果顯示,過表達以及干擾CK8細胞凋亡率明顯升高,差異有統計學意義。2、CK8表達異常參與人膽管細胞RBE線粒體形態(tài)和功能變化激光共聚焦實驗結果顯示,過表達以及干擾CK8細胞線粒體絲狀斷裂,分布不均。流式細胞術實驗結果顯示,過表達以及干擾CK8細胞的活性氧含量明顯升高,差異有統計學意義。3、CK8表達異常介導人膽管細胞RBE AKT信號通路引起細胞凋亡Western Blot結果顯示過表達或干擾CK8細胞AKT的磷酸化蛋白水平明顯下調,總蛋白水平無明顯變化;AKT下游的抑制凋亡相關蛋白Bcl-2表達明顯下調,抗凋亡蛋白Cleaved caspase-3明顯上調。4、GCDC促進CK8表達異常人膽管細胞RBE角蛋白破壞、線粒體損傷以及細胞凋亡激光共聚焦實驗結果顯示,GCDC作用細胞角蛋白成團狀、且分布不均,細胞核固縮、碎裂,細胞線粒體絲狀斷裂,分布不均。流式細胞術實驗結果顯示,GCDC作用細胞凋亡率明顯升高,細胞的活性氧含量明顯升高,差異有統計學意義,且在1mM時凋亡最明顯�！窘Y論】CK8表達異常促進人膽管細胞RBE凋亡,參與線粒體形態(tài)和功能變化,可能部分介導AKT信號通路引起細胞凋亡;GCDC促進CK8表達異常人膽管細胞RBE角蛋白破壞、線粒體損傷以及細胞凋亡,且具有濃度依賴性。
【關鍵詞】：角蛋白8 原發(fā)性膽汁性肝硬化 人膽管細胞 線粒體 凋亡
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-21
• 第一部分 慢病毒載體感染人膽管細胞系的建立21-30
• 1 材料21-23
• 1.1 細胞系21
• 1.2 質粒和慢病毒21-22
• 1.3 主要實驗試劑22-23
• 1.4 主要實驗儀器23
• 2 方法23-27
• 2.1 慢病毒載體的構建23-24
• 2.2 細胞培養(yǎng)24
• 2.3 慢病毒感染細胞24-25
• 2.4 細胞總RNA提取以及定量25
• 2.5 熒光實時定量PCR25-26
• 2.5.1 mRNA反轉錄25
• 2.5.2 RT-PCR25-26
• 2.6 Western Blot26-27
• 2.6.1 細胞總蛋白的制備26
• 2.6.2 SDS-PAGE26
• 2.6.3 Western Blot26-27
• 2.7 統計學處理27
• 3 結果27-28
• 4 討論28-30
• 第二部分 角蛋白8表達量異常與人膽管上皮細胞凋亡之間的關系30-41
• 1 材料和儀器30-31
• 1.1 細胞系30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 主要實驗儀器31
• 2 方法31-34
• 2.1 細胞培養(yǎng)31
• 2.2 慢病毒感染細胞31-32
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察角蛋白以及細胞核形態(tài)32
• 2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察活細胞線粒體形態(tài)變化32
• 2.5 流式細胞儀檢測細胞內ROS含量32-33
• 2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡33
• 2.7 Western Blot檢測凋亡相關蛋白的表達33-34
• 2.8 統計學處理34
• 3 結果34-38
• 3.1 過表達以及干擾CK8細胞角蛋白形態(tài)發(fā)生變化34
• 3.2 過表達及干擾CK8與細胞的凋亡正相關34-36
• 3.3 過表達及干擾CK8后線粒體的形態(tài)和功能的變化36-37
• 3.4 過表達及干擾CK8后細胞凋亡相關蛋白以及凋亡相關信號通路蛋白的變化37-38
• 4 討論38-41
• 第三部分 膽汁酸鹽促進角蛋白8表達異常的人膽管上皮細胞凋亡41-54
• 1 材料和儀器41-43
• 1.1 細胞株41
• 1.2 主要試劑41-42
• 1.3 主要實驗儀器42-43
• 2 方法43-45
• 2.1 細胞培養(yǎng)43
• 2.2 慢病毒感染細胞43
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察角蛋白以及細胞核形態(tài)43-44
• 2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察活細胞中線粒體形態(tài)的動態(tài)變化44
• 2.5 流式細胞儀檢測細胞內ROS的含量44
• 2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡44-45
• 2.7 Western Blot檢測凋亡相關蛋白的表達45
• 2.8 統計學處理45
• 3 結果45-50
• 3.1 膽汁酸鹽促進過表達以及干擾CK8慢病毒載體感染的RBE細胞凋亡45-47
• 3.2 膽汁酸鹽促進過表達及干擾CK8后細胞線粒體損傷47-49
• 3.3 GCDC作用過表達及干擾CK8后細胞凋亡相關蛋白以及凋亡相關信號通路蛋白的變化49-50
• 4 討論50-54
• 小結54-55
• 參考文獻55-62
• 附錄62-63
• 個人簡歷和研究成果63-64
• 致謝64

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