本文關(guān)鍵詞：角蛋白8參與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管上皮細(xì)胞凋亡、線(xiàn)粒體損傷及其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

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【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一種以肝內(nèi)中小膽管進(jìn)行性破壞為特征的自身免疫性膽汁淤積性肝臟疾病。約90%-95%的PBC患者可檢測(cè)到抗線(xiàn)粒體抗體(Anti-mitochondrial antibodies,AMA),線(xiàn)粒體何種成分失去免疫耐受引起PBC發(fā)病并不清楚。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜損傷、卷曲以及外翻使細(xì)胞內(nèi)容物外漏,線(xiàn)粒體成分降解清除障礙,產(chǎn)生免疫原性片段可能誘發(fā)了PBC。角蛋白(Cytokeratin,CK)是細(xì)胞骨架蛋白中間絲家族中數(shù)量最多和最重要的成員,不僅具有保護(hù)細(xì)胞、維持線(xiàn)粒體正常結(jié)構(gòu)的功能,而且參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等重要生理病理過(guò)程。角蛋白缺失或異常表達(dá)與疾病密切相關(guān)。研究表明,過(guò)表達(dá)CK8會(huì)引發(fā)小鼠慢性胰腺炎;CK8-/-的小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎;乳腺癌中CK8的表達(dá)明顯上調(diào)。近年來(lái),有學(xué)者認(rèn)為CK8缺失或表達(dá)異常同肝臟疾病發(fā)病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),小鼠肝臟損傷時(shí),CK8以及CK18 m RNA和蛋白的表達(dá)量可升高3倍[8,29]。CK8-/-小鼠可出現(xiàn)慢性肝炎,肝細(xì)胞損傷、凋亡[30],C57/B1 CK8-/-小鼠約94%胚胎期死亡并伴廣泛肝出血、肝損傷[31],FVB/N CK8-/-小鼠55%有正常的生存期,但在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)為輕微肝炎、肝巨噬細(xì)胞異常和肝細(xì)胞增生,予膠原酶灌注后出現(xiàn)明顯肝壞死,對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性明顯增加[9]。另外有研究報(bào)道,CK8表達(dá)異常可能同PBC發(fā)病相關(guān)。PBC患者體內(nèi)可檢測(cè)到抗CK8自身抗體,PBC患者肝臟CK8/CK18的蛋白含量可升高2-4倍。國(guó)外研究也證實(shí)在PBC患者中CK8突變明顯升高,CK8缺失或表達(dá)異常與PBC的嚴(yán)重程度相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)CK8-/-小鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)、功能發(fā)生變化,且血清抗線(xiàn)粒體抗體(Anti-mitochondrial antibodies,AMA)陽(yáng)性。以上研究提示:CK8缺失或異常表達(dá)可能參與PBC的發(fā)病,但是,CK8缺失或表達(dá)異常在PBC發(fā)病中扮演的角色并不清楚。本研究探討CK8是否通過(guò)影響線(xiàn)粒體功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與PBC發(fā)病�！灸康摹�1、研究過(guò)表達(dá)以及干擾CK8對(duì)人膽管細(xì)胞RBE凋亡的影響;2、研究過(guò)表達(dá)以及干擾CK8對(duì)人膽管細(xì)胞RBE線(xiàn)粒體形態(tài)和功能的影響;3、探討CK8表達(dá)異常通過(guò)何種信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。【方法】1、構(gòu)建CK8過(guò)表達(dá)以及干擾慢病毒載體,感染人膽管細(xì)胞RBE,建立CK8過(guò)表達(dá)以及干擾細(xì)胞系,采用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)人膽管細(xì)胞RBE中CK8的表達(dá)量;2、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)以及干擾CK8人膽管細(xì)胞RBE凋亡水平變化;3、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)以及干擾CK8人膽管細(xì)胞RBE線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能的變化;4、通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)研究AKT信號(hào)通路在過(guò)表達(dá)以及干擾CK8凋亡中作用;5、采用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析GCDC作用對(duì)人膽管細(xì)胞RBE凋亡的影響;6、采用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析GCDC作用對(duì)線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能的變化;7、通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)研究AKT信號(hào)通路在GCDC作用后CK8表達(dá)異常的人膽管細(xì)胞RBE凋亡中作用;【結(jié)果】1、CK8表達(dá)異常促進(jìn)人膽管細(xì)胞RBE凋亡RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞角蛋白量發(fā)生相應(yīng)改變。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞角蛋白成團(tuán)狀、且分布不均,細(xì)胞核固縮、碎裂。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、CK8表達(dá)異常參與人膽管細(xì)胞RBE線(xiàn)粒體形態(tài)和功能變化激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞線(xiàn)粒體絲狀斷裂,分布不均。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞的活性氧含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、CK8表達(dá)異常介導(dǎo)人膽管細(xì)胞RBE AKT信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡Western Blot結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)或干擾CK8細(xì)胞AKT的磷酸化蛋白水平明顯下調(diào),總蛋白水平無(wú)明顯變化;AKT下游的抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào),抗凋亡蛋白Cleaved caspase-3明顯上調(diào)。4、GCDC促進(jìn)CK8表達(dá)異常人膽管細(xì)胞RBE角蛋白破壞、線(xiàn)粒體損傷以及細(xì)胞凋亡激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GCDC作用細(xì)胞角蛋白成團(tuán)狀、且分布不均,細(xì)胞核固縮、碎裂,細(xì)胞線(xiàn)粒體絲狀斷裂,分布不均。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GCDC作用細(xì)胞凋亡率明顯升高,細(xì)胞的活性氧含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且在1mM時(shí)凋亡最明顯。【結(jié)論】CK8表達(dá)異常促進(jìn)人膽管細(xì)胞RBE凋亡,參與線(xiàn)粒體形態(tài)和功能變化,可能部分介導(dǎo)AKT信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡;GCDC促進(jìn)CK8表達(dá)異常人膽管細(xì)胞RBE角蛋白破壞、線(xiàn)粒體損傷以及細(xì)胞凋亡,且具有濃度依賴(lài)性。
【關(guān)鍵詞】：角蛋白8 原發(fā)性膽汁性肝硬化 人膽管細(xì)胞 線(xiàn)粒體 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-21
• 第一部分 慢病毒載體感染人膽管細(xì)胞系的建立21-30
• 1 材料21-23
• 1.1 細(xì)胞系21
• 1.2 質(zhì)粒和慢病毒21-22
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器23
• 2 方法23-27
• 2.1 慢病毒載體的構(gòu)建23-24
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.3 慢病毒感染細(xì)胞24-25
• 2.4 細(xì)胞總RNA提取以及定量25
• 2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR25-26
• 2.5.1 mRNA反轉(zhuǎn)錄25
• 2.5.2 RT-PCR25-26
• 2.6 Western Blot26-27
• 2.6.1 細(xì)胞總蛋白的制備26
• 2.6.2 SDS-PAGE26
• 2.6.3 Western Blot26-27
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理27
• 3 結(jié)果27-28
• 4 討論28-30
• 第二部分 角蛋白8表達(dá)量異常與人膽管上皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系30-41
• 1 材料和儀器30-31
• 1.1 細(xì)胞系30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器31
• 2 方法31-34
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)31
• 2.2 慢病毒感染細(xì)胞31-32
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察角蛋白以及細(xì)胞核形態(tài)32
• 2.4 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察活細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)變化32
• 2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量32-33
• 2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡33
• 2.7 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)33-34
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理34
• 3 結(jié)果34-38
• 3.1 過(guò)表達(dá)以及干擾CK8細(xì)胞角蛋白形態(tài)發(fā)生變化34
• 3.2 過(guò)表達(dá)及干擾CK8與細(xì)胞的凋亡正相關(guān)34-36
• 3.3 過(guò)表達(dá)及干擾CK8后線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能的變化36-37
• 3.4 過(guò)表達(dá)及干擾CK8后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化37-38
• 4 討論38-41
• 第三部分 膽汁酸鹽促進(jìn)角蛋白8表達(dá)異常的人膽管上皮細(xì)胞凋亡41-54
• 1 材料和儀器41-43
• 1.1 細(xì)胞株41
• 1.2 主要試劑41-42
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器42-43
• 2 方法43-45
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 2.2 慢病毒感染細(xì)胞43
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察角蛋白以及細(xì)胞核形態(tài)43-44
• 2.4 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察活細(xì)胞中線(xiàn)粒體形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化44
• 2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量44
• 2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡44-45
• 2.7 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)45
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理45
• 3 結(jié)果45-50
• 3.1 膽汁酸鹽促進(jìn)過(guò)表達(dá)以及干擾CK8慢病毒載體感染的RBE細(xì)胞凋亡45-47
• 3.2 膽汁酸鹽促進(jìn)過(guò)表達(dá)及干擾CK8后細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷47-49
• 3.3 GCDC作用過(guò)表達(dá)及干擾CK8后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化49-50
• 4 討論50-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 附錄62-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果63-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：522200