目的:研究大分子擁擠環(huán)境對不同糖基化程度的黏蛋白(MUC5AC)在復(fù)性過程中折疊和聚集的差異效應(yīng)。方法:首先將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HEK293細胞誘導(dǎo)MUC5AC的表達,并用鎳離子親和層析柱純化目的蛋白。用肽N-糖苷酶F(PNGase F)處理純化的MUC5AC進行酶切去糖基化,聚丙烯酰胺凝膠檢測去糖基化結(jié)果。利用蛋白擁擠試劑牛血清白蛋白(BSA)以及多糖擁擠劑聚乙二醇2000(PEG2000)、聚蔗糖70(Ficoll70)和葡聚糖70(Dextran70)在體外模擬生物體內(nèi)的大分子擁擠環(huán)境,設(shè)置擁擠試劑質(zhì)量濃度梯度為50g/L、100 g/L和200 g/L,用不含擁擠試劑的緩沖液作為對照組。將鹽酸胍(GdnHCl)誘導(dǎo)變性的去糖基化蛋白(d-MUC5AC)及未去糖基化的天然蛋白(n-MUC5AC)分別加入到上述四種大分子擁擠試劑和對照組緩沖液中復(fù)性,25℃條件下用紫外分光光度計連續(xù)監(jiān)測復(fù)性過程中各組蛋白在488nm處吸光度的變化。復(fù)性終產(chǎn)物離心后測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)濃度,分析不同復(fù)性體系中蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率結(jié)果:兩種蛋白在質(zhì)量濃度較高(ρ=200 g/L)的擁擠條件下...

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1重組MUC5AC在HEK293中的表達純化

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文18P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1重組MUC5AC在HEK293細胞中的表達純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后，收集轉(zhuǎn)染的細胞，提取細胞總蛋白，然后用Ni-NTA親和層析柱進行純化，流出液經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色鑒定蛋白純化結(jié)果。S....

圖2染色分析MUC5AC去糖基化結(jié)果

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19由40kDa下移至17kDa左右。PAS染色結(jié)果顯示，僅n-MUC5AC在40kDa處顯色，PNGaseF處理后的蛋白未見顯色，說明在HEK293細胞中表達的n-MUC5AC進行了N-糖基化修飾，而經(jīng)PNGaseF糖苷酶消化后糖基基團已基本被去處....

圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文20子擁擠試劑的質(zhì)量濃度ρ選在50或100g/L時兩種蛋白質(zhì)均能很好的復(fù)性，由于生物體內(nèi)的大分子濃度高達80～400g/L[13-15]，因此后續(xù)實驗選用ρ=100g/L作為最適質(zhì)量濃度。圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影....

圖4.不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對d-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文20子擁擠試劑的質(zhì)量濃度ρ選在50或100g/L時兩種蛋白質(zhì)均能很好的復(fù)性，由于生物體內(nèi)的大分子濃度高達80～400g/L[13-15]，因此后續(xù)實驗選用ρ=100g/L作為最適質(zhì)量濃度。圖3不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影....

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