本文關鍵詞：CrkL調控人慢性粒細胞白血病K562細胞的惡性行為及分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML),是起源于骨髓的一種多能造血干細胞惡性克隆增殖性疾病。在我國CML在白血病中占的比例約為20%,僅次于急粒和急淋位居第三位。絕大多數CML具有特征性的Ph染色體。Ph染色體是9號染色體和22號染色體之間發(fā)生易位作用,即t(9;22)(q34;q11),這樣的易位作用使位于第9號染色體q34的ABL基因與第22號染色體q11的BCR基因形成了BCR-ABL融合基因(5'-3'),該基因編碼的BCR-ABL融合蛋白分子量為210Kda,具有異常的酪氨酸激酶活性。目前的研究表明,BCR-ABL蛋白激酶可以誘發(fā)多條信號轉導通路的異常激活(簡稱BCR-ABL通路),引起細胞過度增殖,凋亡受抑制以及粘附、遷移侵襲能力的改變,最終導致細胞的惡性轉化。Crk最初作為一種癌基因產物發(fā)現于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要由SH2(src homology 2)和SH3(src homology 3)結構域組成。Crk家族包括三個成員:Crk I、Crk II和Crk L,在各個組織中廣泛表達。近年來的研究表明:Crk L異常表達與腫瘤生物學行為密切相關,但Crk L與慢性粒細胞白血病(CML)發(fā)病機制及可能參與的信號通路的研究相對較少。在BCR-ABL通路中Crk L作為BCR-ABL通路中BCR-ABL激酶的重要的底物之一,在細胞中以持續(xù)性磷酸化的狀態(tài)存在,通過其SH2、SH3結構域可以招募各通路信號轉導分子,起著信號開關的作用,在BCR-ABL通路中扮演重要的角色。目的:1、構建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表達載體并穩(wěn)定轉染至CML細胞株K562中,獲得Crk L表達穩(wěn)定下調的單克隆sh RNA-Crk L-K562細胞株;2、研究Crk L下調對K562細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、周期、凋亡、耐藥性生物學行為影響;3、研究Crk L在慢性粒細胞白血病中主要參與的分子機制。方法:1、依據Crk L的m RNA序列(NM_005207.3),利用si Direct和whitehead軟件設計針對Crk L的si RNA,同時設計無關序列作為陰性對照。利用Lipofectamine 2000介導法,將構建好的p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表達載體及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-control無關序列表達載體分別轉染至K562細胞中,24h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率,經500ug/ml G418篩選及有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉染的K562單克隆細胞株。采用q RT-PCR和Western Blot驗證各組單克隆細胞、單克隆無關序列細胞和K562細胞株中Crk L蛋白的表達水平。2、透射電鏡觀察下調對K562細胞亞顯微結構的影響;3、臺盼藍計數法測定Crk L下調對K562細胞增殖能力的影響;4、甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)各組細胞株測定Crk L下調對K562細胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室測定Crk L下調對K562細胞遷移和侵襲能力的影響;6、流式細胞術檢測Crk L下調對K562細胞周期的影響;7、Heochst33342染色檢測Crk L下調對K562細胞凋亡和Imatinib mesylate耐藥性影響;8、q RT-PCR和Western Blot研究Crk L下調對K562細胞生物學行為影響的分子機制。結果:1、設計了3條針對Crk L的si RNA,且成功構建了3種重組質粒:p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-439、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-710、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-796;2、篩選得到20株單克隆細胞株,q RT-PCR和Western blot結果表明:相對于陰性對照組,在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調細胞株中Crk L的表達水平明顯減少,其m RNA下調率分別是84.2±1.2%和79.1±0.1%;蛋白水平下調率91.0±1.8%和87.5±0.3%,sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調細胞株作為后續(xù)的功能實驗細胞株;3、在透射電鏡下觀察,下調細胞株中線粒體出現明顯腫大現象,表明細胞有前期凋亡跡象;4、臺盼藍細胞計數檢測結果顯示:下調細胞株在細胞培養(yǎng)48小時后,增殖速度顯著低于陰性對照組(P0.05);5、Transwell小室細胞遷移和侵襲檢測結果顯示:在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調細胞株中,遷移和侵襲的細胞數明顯少于陰性對照組(P0.05);6、甲基纖維素克隆形成實驗結果顯示:下調細胞株克隆形成的數目和克隆形成的體積都明顯低于陰性對照組(P0.05);7、sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調細胞株與陰性對照組相比,Crk L下調使細胞周期阻滯于S期;8、Heochst33258染色檢測結果顯示:Crk L下調細胞出現輕微的凋亡,同時對Imatinib mesylate的敏感性更強;9、Crk L下調能夠促進K562細胞向巨核細胞分化;10、分子機制研究表明,Crk L在K562細胞中通過PI3K-Akt/m TO R通路、MAPK通路、FAK/Src通路、Crk L-STAT5通路和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1通路來影響K562細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、Imatinib mesylate耐藥性。結論:1、成功構建了p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L和對照組表達載體;2、成功獲得Crk L表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株,為進一步研究Crk L在慢性粒細胞白血病中的作用奠定了基礎;3、Crk L下調能夠抑制CML細胞株K562的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、促進細胞凋亡、降低Imatinib mesylate耐藥性,將細胞周期阻滯在S期,并促進細胞向巨核細胞分化;4、Crk L下調通過調控多條信號轉導通路包括PI3K-Akt/m TOR、MAPK、FAK/Src、Crk L-STAT5和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1來抑制CML的惡性轉化。Crk L在慢性粒細胞白血病生物學行為中發(fā)揮重要作用,有望成為新的CML基因治療的分子靶點。
【關鍵詞】：慢性粒細胞白血病 CrkL K562細胞 耐藥性 分子機制
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.72
【目錄】：

• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 第一部分 CrkL表達穩(wěn)定下調的慢性粒細胞性白血病K562細胞株的建立17-30
• 材料和方法17-23
• 1. 材料17-18
• 1.1 細胞系及培養(yǎng)條件17
• 1.2 主要試劑及儀器17-18
• 2. 方法18-23
• 2.1 載體的構建與驗證18-19
• 2.2 CrkL表達穩(wěn)定下調的慢性粒細胞白血病K562細胞株的建立19-23
• 2.3 統(tǒng)計學分析23
• 結果23-26
• 1. K562細胞轉染效率23-24
• 2. Western blot 檢測各組單克隆細胞株 CrkL 蛋白水平24
• 3. q RT-PCR 檢測各組細胞 CrkL mRNA 水平24-25
• 4. Western blot檢測各組單克隆細胞株磷酸化CrkL蛋白水平25-26
• 討論26-27
• 結論27
• 參考文獻27-30
• 第二部分 CrkL對慢性粒細胞性白血病K562細胞惡性行為的影響及分子機制研究30-66
• 材料和方法30-36
• 1. 材料30-32
• 1.1 細胞系及培養(yǎng)條件30
• 1.2 主要試劑及儀器30-32
• 2. 方法32-36
• 2.1 CrkL穩(wěn)定轉染K562細胞形態(tài)表征32
• 2.2 臺盼藍計數法測定CrkL下調對K562細胞增殖能力的影響32-33
• 2.3 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測CrkL下調對K562細胞克隆形成能力的影響33
• 2.4 Transwell小室法檢測CrkL下調對K562細胞遷移能力的影響33-34
• 2.5 Transwell小室法檢測CrkL下調對K562細胞侵襲能力的影響34
• 2.6 流式細胞術檢測CrkL下調對K562細胞周期的影響34
• 2.7 CrkL下調對K562細胞Imatinib mesylate耐藥性的影響34
• 2.8 Hoechst33258檢測CrkL下調對K562細胞Imatinib mesylate誘導凋亡的影響34-35
• 2.9 CrkL下調對K562細胞BCL-X、BCL-2、c-MYC、FAK、STAT5A、STAT5B、p-STAT5、ERK1/2、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、p-c-JUN、p130CAS、Rac1、Rap1、DOCK180和p-mTOR蛋白表達水平的影響35
• 2.10 CrkL下調對K562細胞MMP2、MMP9、E-cadherin、BCRP、c-SRC、CD41、CD61 mRNA表達水平的影響35-36
• 結果36-55
• 1. CrkL下調對K562細胞亞顯微結構的影響36-37
• 2. CrkL下調抑制K562細胞體外增殖能力37
• 3. CrkL下調抑制K562細胞體外克隆形成能力37-38
• 4. CrkL下調抑制K562細胞體外遷移能力38-39
• 5. CrkL下調抑制K562細胞體外侵襲能力39-40
• 6. CrkL下調對K562細胞周期的影響40-41
• 7. CrkL下調對K562細胞凋亡有一定促進作用41-42
• 8. CrkL下調對K562細胞Imatinib mesylate耐藥性的影響42-43
• 9. CrkL下調促進K562細胞向巨核系分化43-45
• 10. CrkL下調對K562細胞相關信號通路的影響45-55
• 討論55-59
• 結論59
• 參考文獻59-66
• 綜述66-76
• 參考文獻71-76
• 致謝76-77

【相似文獻】

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本文編號：398782