本文關(guān)鍵詞：CrkL調(diào)控人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的惡性行為及分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML),是起源于骨髓的一種多能造血干細(xì)胞惡性克隆增殖性疾病。在我國(guó)CML在白血病中占的比例約為20%,僅次于急粒和急淋位居第三位。絕大多數(shù)CML具有特征性的Ph染色體。Ph染色體是9號(hào)染色體和22號(hào)染色體之間發(fā)生易位作用,即t(9;22)(q34;q11),這樣的易位作用使位于第9號(hào)染色體q34的ABL基因與第22號(hào)染色體q11的BCR基因形成了BCR-ABL融合基因(5'-3'),該基因編碼的BCR-ABL融合蛋白分子量為210Kda,具有異常的酪氨酸激酶活性。目前的研究表明,BCR-ABL蛋白激酶可以誘發(fā)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活(簡(jiǎn)稱BCR-ABL通路),引起細(xì)胞過度增殖,凋亡受抑制以及粘附、遷移侵襲能力的改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Crk最初作為一種癌基因產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要由SH2(src homology 2)和SH3(src homology 3)結(jié)構(gòu)域組成。Crk家族包括三個(gè)成員:Crk I、Crk II和Crk L,在各個(gè)組織中廣泛表達(dá)。近年來的研究表明:Crk L異常表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān),但Crk L與慢性粒細(xì)胞白血病(CML)發(fā)病機(jī)制及可能參與的信號(hào)通路的研究相對(duì)較少。在BCR-ABL通路中Crk L作為BCR-ABL通路中BCR-ABL激酶的重要的底物之一,在細(xì)胞中以持續(xù)性磷酸化的狀態(tài)存在,通過其SH2、SH3結(jié)構(gòu)域可以招募各通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,起著信號(hào)開關(guān)的作用,在BCR-ABL通路中扮演重要的角色。目的:1、構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CML細(xì)胞株K562中,獲得Crk L表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆sh RNA-Crk L-K562細(xì)胞株;2、研究Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、周期、凋亡、耐藥性生物學(xué)行為影響;3、研究Crk L在慢性粒細(xì)胞白血病中主要參與的分子機(jī)制。方法:1、依據(jù)Crk L的m RNA序列(NM_005207.3),利用si Direct和whitehead軟件設(shè)計(jì)針對(duì)Crk L的si RNA,同時(shí)設(shè)計(jì)無關(guān)序列作為陰性對(duì)照。利用Lipofectamine 2000介導(dǎo)法,將構(gòu)建好的p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L表達(dá)載體及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-control無關(guān)序列表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞中,24h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,經(jīng)500ug/ml G418篩選及有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的K562單克隆細(xì)胞株。采用q RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證各組單克隆細(xì)胞、單克隆無關(guān)序列細(xì)胞和K562細(xì)胞株中Crk L蛋白的表達(dá)水平。2、透射電鏡觀察下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響;3、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法測(cè)定Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞增殖能力的影響;4、甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)各組細(xì)胞株測(cè)定Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室測(cè)定Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞周期的影響;7、Heochst33342染色檢測(cè)Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞凋亡和Imatinib mesylate耐藥性影響;8、q RT-PCR和Western Blot研究Crk L下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分子機(jī)制。結(jié)果:1、設(shè)計(jì)了3條針對(duì)Crk L的si RNA,且成功構(gòu)建了3種重組質(zhì)粒:p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-439、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-710、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L-796;2、篩選得到20株單克隆細(xì)胞株,q RT-PCR和Western blot結(jié)果表明:相對(duì)于陰性對(duì)照組,在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調(diào)細(xì)胞株中Crk L的表達(dá)水平明顯減少,其m RNA下調(diào)率分別是84.2±1.2%和79.1±0.1%;蛋白水平下調(diào)率91.0±1.8%和87.5±0.3%,sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調(diào)細(xì)胞株作為后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株;3、在透射電鏡下觀察,下調(diào)細(xì)胞株中線粒體出現(xiàn)明顯腫大現(xiàn)象,表明細(xì)胞有前期凋亡跡象;4、臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:下調(diào)細(xì)胞株在細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,增殖速度顯著低于陰性對(duì)照組(P0.05);5、Transwell小室細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)結(jié)果顯示:在sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調(diào)細(xì)胞株中,遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組(P0.05);6、甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:下調(diào)細(xì)胞株克隆形成的數(shù)目和克隆形成的體積都明顯低于陰性對(duì)照組(P0.05);7、sh RNA-Crk L-K562(1),sh RNA-Crk L-K562(2)下調(diào)細(xì)胞株與陰性對(duì)照組相比,Crk L下調(diào)使細(xì)胞周期阻滯于S期;8、Heochst33258染色檢測(cè)結(jié)果顯示:Crk L下調(diào)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的凋亡,同時(shí)對(duì)Imatinib mesylate的敏感性更強(qiáng);9、Crk L下調(diào)能夠促進(jìn)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化;10、分子機(jī)制研究表明,Crk L在K562細(xì)胞中通過PI3K-Akt/m TO R通路、MAPK通路、FAK/Src通路、Crk L-STAT5通路和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1通路來影響K562細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、Imatinib mesylate耐藥性。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Crk L和對(duì)照組表達(dá)載體;2、成功獲得Crk L表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株,為進(jìn)一步研究Crk L在慢性粒細(xì)胞白血病中的作用奠定了基礎(chǔ);3、Crk L下調(diào)能夠抑制CML細(xì)胞株K562的增殖、克隆形成、遷移和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低Imatinib mesylate耐藥性,將細(xì)胞周期阻滯在S期,并促進(jìn)細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化;4、Crk L下調(diào)通過調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括PI3K-Akt/m TOR、MAPK、FAK/Src、Crk L-STAT5和p130CAS/Crk L/Dock180/RAC1來抑制CML的惡性轉(zhuǎn)化。Crk L在慢性粒細(xì)胞白血病生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用,有望成為新的CML基因治療的分子靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：慢性粒細(xì)胞白血病 CrkL K562細(xì)胞 耐藥性 分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.72
【目錄】：

• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 第一部分 CrkL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞株的建立17-30
• 材料和方法17-23
• 1. 材料17-18
• 1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件17
• 1.2 主要試劑及儀器17-18
• 2. 方法18-23
• 2.1 載體的構(gòu)建與驗(yàn)證18-19
• 2.2 CrkL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株的建立19-23
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 結(jié)果23-26
• 1. K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率23-24
• 2. Western blot 檢測(cè)各組單克隆細(xì)胞株 CrkL 蛋白水平24
• 3. q RT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞 CrkL mRNA 水平24-25
• 4. Western blot檢測(cè)各組單克隆細(xì)胞株磷酸化CrkL蛋白水平25-26
• 討論26-27
• 結(jié)論27
• 參考文獻(xiàn)27-30
• 第二部分 CrkL對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞惡性行為的影響及分子機(jī)制研究30-66
• 材料和方法30-36
• 1. 材料30-32
• 1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件30
• 1.2 主要試劑及儀器30-32
• 2. 方法32-36
• 2.1 CrkL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞形態(tài)表征32
• 2.2 臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法測(cè)定CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞增殖能力的影響32-33
• 2.3 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測(cè)CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞克隆形成能力的影響33
• 2.4 Transwell小室法檢測(cè)CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞遷移能力的影響33-34
• 2.5 Transwell小室法檢測(cè)CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞侵襲能力的影響34
• 2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞周期的影響34
• 2.7 CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞Imatinib mesylate耐藥性的影響34
• 2.8 Hoechst33258檢測(cè)CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞Imatinib mesylate誘導(dǎo)凋亡的影響34-35
• 2.9 CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞BCL-X、BCL-2、c-MYC、FAK、STAT5A、STAT5B、p-STAT5、ERK1/2、p-ERK1/2、p-AKT、p-JNK、p-c-JUN、p130CAS、Rac1、Rap1、DOCK180和p-mTOR蛋白表達(dá)水平的影響35
• 2.10 CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞MMP2、MMP9、E-cadherin、BCRP、c-SRC、CD41、CD61 mRNA表達(dá)水平的影響35-36
• 結(jié)果36-55
• 1. CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響36-37
• 2. CrkL下調(diào)抑制K562細(xì)胞體外增殖能力37
• 3. CrkL下調(diào)抑制K562細(xì)胞體外克隆形成能力37-38
• 4. CrkL下調(diào)抑制K562細(xì)胞體外遷移能力38-39
• 5. CrkL下調(diào)抑制K562細(xì)胞體外侵襲能力39-40
• 6. CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞周期的影響40-41
• 7. CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞凋亡有一定促進(jìn)作用41-42
• 8. CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞Imatinib mesylate耐藥性的影響42-43
• 9. CrkL下調(diào)促進(jìn)K562細(xì)胞向巨核系分化43-45
• 10. CrkL下調(diào)對(duì)K562細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的影響45-55
• 討論55-59
• 結(jié)論59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 綜述66-76
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 致謝76-77

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