本文關(guān)鍵詞：女貞苷和TBC1D1調(diào)控脂聯(lián)素高聚化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細(xì)胞分泌水平最高的脂肪因子,血漿中主要以低聚體、中聚體和高聚體三種聚體形式存在。三種聚體功能各不相同,其中高聚體是脂聯(lián)素調(diào)節(jié)代謝功能的主要形式,具有提高胰島素敏感性的功能。脂聯(lián)素高聚體與總量比值(HMW/Total Ad)常常被用來衡量脂聯(lián)素高聚化水平,可以作為預(yù)測和診斷胰島素抵抗相關(guān)疾病的生物指標(biāo)。AMPK是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶,在細(xì)胞中調(diào)節(jié)能量代謝。我們前期研究證明,激活A(yù)MPK可以促進(jìn)脂聯(lián)素的高聚化。女貞苷是中藥材女貞子的主要藥理活性成分,臨床主要用于治療須發(fā)早白、眩暈耳鳴、目暗不明等癥。本研究發(fā)現(xiàn),女貞苷在HEK293T和3T3-L1脂肪細(xì)胞中均能有效激活A(yù)MPK;在3T3-L1細(xì)胞中通過激活A(yù)MPK促進(jìn)脂聯(lián)素高聚體的組裝。為了進(jìn)一步研究AMPK調(diào)控脂聯(lián)素高聚化的分子機(jī)制,實(shí)驗(yàn)前期通過免疫共沉淀、質(zhì)譜檢測等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了脂聯(lián)素結(jié)合蛋白TBC1D1。該蛋白是一種GTPase激活蛋白,含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),主要有Ser237,Thr596等,能被AMPK磷酸化。本研究通過在3T3-L1細(xì)胞中沉默TBC1D1蛋白,HEK293T細(xì)胞中過量表達(dá)脂聯(lián)素和TBC1D1(及其突變體)發(fā)現(xiàn),TBC1D1去磷酸化狀態(tài)可以提高細(xì)胞中HMW/Total Ad的比值,促進(jìn)脂聯(lián)素高聚體的組裝。通過間接免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn),去磷酸化狀態(tài)的TBC1D1有利于它在細(xì)胞中和脂聯(lián)素的共定位。本課題一方面發(fā)現(xiàn)了一種新的有效的AMPK激活劑女貞苷,另一方面初步闡明了TBC1D1作為AMPK下游蛋白對脂聯(lián)素高聚體的組裝所發(fā)揮的作用:TBC1D1通過被AMPK磷酸化和去磷酸化,調(diào)控脂聯(lián)素的總量和高聚體的組裝。
【關(guān)鍵詞】：脂聯(lián)素 AMPK TBC1D1 女貞苷 高聚化
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 主要符號對照表8-9
• 第1章 前言9-21
• 1.1 脂聯(lián)素9-13
• 1.1.1 脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)9
• 1.1.2 脂聯(lián)素的表達(dá)及調(diào)控9-10
• 1.1.3 脂聯(lián)素的組裝和分泌10-12
• 1.1.4 脂聯(lián)素的功能和作用機(jī)制12-13
• 1.2 AMPK13-16
• 1.2.1 AMPK的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2.2 AMPK的功能14-15
• 1.2.3 AMPK的激活機(jī)制與AMPK激活劑15-16
• 1.3 TBC1D116-18
• 1.3.1 TBC1D1基因和蛋白結(jié)構(gòu)16
• 1.3.2 TBC1D1的功能和作用機(jī)制16-17
• 1.3.3 TBC1D1的磷酸化17-18
• 1.4 女貞苷18-19
• 1.5 研究目的和意義19-21
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品21-23
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-32
• 2.2.1 基因定點(diǎn)突變24-25
• 2.2.2 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化25-26
• 2.2.3 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染26-27
• 2.2.4 RNA干擾（RNAi）27
• 2.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting）27-29
• 2.2.6 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）29-30
• 2.2.7 免疫熒光染色30
• 2.2.8 高效液相色譜（HPLC）30-31
• 2.2.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31-32
• 第3章 女貞苷通過激活A(yù)MPK促進(jìn)脂聯(lián)素的高聚化32-39
• 3.1 本章導(dǎo)論32
• 3.2 女貞苷在HEK293T細(xì)胞中激活A(yù)MPK32-33
• 3.3 女貞苷通過提高細(xì)胞中AMP/ATP的比值激活A(yù)MPK33-34
• 3.4 女貞苷在 3T3-L1脂肪細(xì)胞中激活A(yù)MPK34-35
• 3.5 女貞苷在 3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中促進(jìn)脂聯(lián)素組裝35-36
• 3.6 女貞苷通過激活A(yù)MPK促進(jìn)脂聯(lián)素高聚化36-38
• 3.7 本章小結(jié)38-39
• 第4章 TBC1D1調(diào)控脂聯(lián)素的高聚化39-52
• 4.1 本章導(dǎo)論39
• 4.2 TBC1D1在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)39-40
• 4.3 TBC1D1與脂聯(lián)素的結(jié)合40-41
• 4.3.1 HEK293T細(xì)胞中TBC1D1與脂聯(lián)素的結(jié)合40-41
• 4.3.2 3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中TBC1D1與脂聯(lián)素的結(jié)合41
• 4.4 TBC1D1對脂聯(lián)素高聚體組裝的影響41-46
• 4.4.1 HEK293T中過量表達(dá)TBC1D1降低脂聯(lián)素高聚化水平41-43
• 4.4.2 3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中沉默TBC1D1降低脂聯(lián)素高聚化水平43-44
• 4.4.3 TBC1D1調(diào)控脂聯(lián)素高聚化受上游信號通路介導(dǎo)44-46
• 4.5 磷酸化的TBC1D1抑制脂聯(lián)素高聚化46-47
• 4.6 過表達(dá)TBC1D1磷酸化位點(diǎn)突變體降低脂聯(lián)素的總量47-49
• 4.7 脂聯(lián)素和TBC1D1在HEK293T細(xì)胞中的亞定位49-50
• 4.8 本章小結(jié)50-52
• 第5章 討論與展望52-55
• 5.1 討論52-54
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-53
• 5.1.2 TBC1D1在不同細(xì)胞中的作用53
• 5.1.3 TBC1D1和脂聯(lián)素的關(guān)系53-54
• 5.1.4 TBC1D1磷酸化的檢測54
• 5.2 展望54-55
• 5.2.1 優(yōu)化AMPK激活劑篩選方法54
• 5.2.2 研究TBC1D1和脂聯(lián)素的相互作用54
• 5.2.3 研究TBC1D1蛋白在脂肪細(xì)胞中的其他功能54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62-64
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果64

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本文編號：369495