背景:乙型肝炎病毒感染是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)估計,全球慢性HBV感染者約有2.57億,而中國的慢性HBV感染者約有8600萬。慢性HBV感染嚴(yán)重危害人類健康,可逐漸發(fā)展為肝炎、肝硬化和肝癌,每年因HBV感染導(dǎo)致的各種終末期疾病死亡約88.7萬。目前,臨床上用于治療慢性HBV感染的藥物主要分為核苷（酸）類似物和干擾素,然而這兩種藥物均不能完全清除HBV。因此,研發(fā)一種新型抗HBV藥物至關(guān)重要。我們通過篩查小分子化合物庫,發(fā)現(xiàn)SIRT6抑制劑OSS₂8167可有效地抑制HBV的復(fù)制。本研究利用HBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系Hep G2.2.15細(xì)胞、HBV感染細(xì)胞模型Hep G2-NTCP細(xì)胞及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型全面系統(tǒng)研究了OSS₂8167對HBV復(fù)制的影響,并進(jìn)一步闡明了其發(fā)揮抗病毒作用的分子機(jī)制。目的:1.在Hep G2.2.15和Hep G2-NTCP細(xì)胞中研究SIRT6抑制劑OSS₁28167對HBV復(fù)制的影響。2.在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型中研究OSS₁28167的抗病毒作用。3.闡明OSS_... 

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對照
中文摘要
英文摘要
前言
    參考文獻(xiàn)
第一部分 體外驗證SIRT6 抑制劑,OSS_128167對HBV復(fù)制的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞
            1.1.2 小分子化合物、質(zhì)粒和抗體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器設(shè)備
            1.1.5 主要試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.2 MTS實驗分析OSS_128167在HepG2.2.15和HepG2-NTCP細(xì)胞中的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)
            1.2.3 HBV core DNA的提取及檢測(real-time PCR)
            1.2.4 Southern blot
            1.2.5 RNA的提取及檢測
            1.2.6 ELISA檢測HBsAg的分泌
            1.2.7 ELISA檢測HBeAg的分泌
            1.2.8 Western blot
            1.2.9 分析OSS_128167對HepG2.2.15和已感染HBV的HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV復(fù)制的影響
    2 結(jié)果
        2.1 OSS_128167在HepG2.2.15和HepG2-NTCP細(xì)胞中的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)大于400μM
        2.2 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV的復(fù)制水平
        2.3 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV3.5-kb RNA的水平
        2.4 OSS_128167 可降低HepG2.2.15 和已感染HBV的 HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV蛋白的表達(dá)
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 體內(nèi)驗證SIRT6 抑制劑,OSS_128167 的抗病毒作用
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 動物
            1.1.2 抗體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠實驗流程
            1.2.2 小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的檢測
            1.2.3 小鼠血清中HBV DNA的提取與檢測
            1.2.4 小鼠血清中HBsAg和 HBeAg水平的檢測
            1.2.5 小鼠肝臟中HBV DNA的提取與檢測
            1.2.6 小鼠肝臟中HBV RNAs的提取與檢測
            1.2.7 免疫組化小鼠肝臟中HBc蛋白質(zhì)水平的檢測
    2 結(jié)果
        2.1 OSS_128167 處理不影響HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中ALT的水平
        2.2 OSS_128167 處理后,HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中病毒復(fù)制的指標(biāo)呈時間依賴性降低
        2.3 OSS_128167 處理可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中病毒復(fù)制的指標(biāo)
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
第三部分 SIRT6 抑制劑,OSS_128167 調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的分子機(jī)制研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞
            1.1.2 質(zhì)粒和抗體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 驗證SIRT6沉默水平
            1.2.2 分析SIRT6 沉默對HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響
            1.2.3 分析OSS_128167 是否通過調(diào)控SIRT6 影響HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制
            1.2.4 cccDNA的提取及檢測
            1.2.5 免疫熒光技術(shù)檢測SIRT6 沉默對HBc蛋白質(zhì)水平的影響
            1.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測SIRT6對HBV啟動子活性的影響
            1.2.7 分析SIRT6對HBV Cp活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
            1.2.8 分析SIRT6 沉默對PPARα表達(dá)水平的影響
            1.2.9 分析OSS_128167對PPARα表達(dá)水平的影響
            1.2.10 檢測PPARα沉默對HBV核心啟動子活性的影響
            1.2.11 檢測PPARα沉默對HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響
            1.2.12 分析PPARα是否參與了SIRT6促HBV復(fù)制的過程
            1.2.13 分析SIRT6和PPARα是否參與了OSS_128167 的抗HBV過程
    2 結(jié)果
        2.1 SIRT6 沉默可抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制
        2.2 OSS_128167 通過調(diào)控SIRT6 抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制
        2.3 SIRT6 過表達(dá)顯著增強(qiáng)HBV Cp的轉(zhuǎn)錄活性
        2.4 SIRT6 過表達(dá)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PPARα的表達(dá)
        2.5 OSS_128167 處理下調(diào)PPARα的表達(dá)
        2.6 PPARα沉默可抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制
        2.7 SIRT6和PPARα參與了OSS_128167 的抗HBV過程
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
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【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2015年中國惡性腫瘤流行情況分析[J]. 鄭榮壽,孫可欣,張思維,曾紅梅,鄒小農(nóng),陳茹,顧秀瑛,魏文強(qiáng),赫捷.  中華腫瘤雜志. 2019 (01)
[2]靶向HBV共價閉合環(huán)狀DNA的治療策略[J]. 李強(qiáng),卓其斌,黃玉仙,陳良.  臨床肝膽病雜志. 2015(09)



本文編號：3690299