本文關(guān)鍵詞：四株海洋來源微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：海洋是一種獨(dú)特復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),蘊(yùn)含著豐富的生物資源。海洋極端和特殊的生存環(huán)境,使海洋微生物演化形成了較為特殊的代謝機(jī)制和途徑,其產(chǎn)生的胞外多糖在結(jié)構(gòu)和活性功能上新穎多樣。本文以4種不同海洋生境來源的微生物發(fā)酵液為研究對象,從中分離純化胞外多糖,并對其進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)構(gòu)解析及體外抗氧化活性測定。研究結(jié)果如下：1.從黃河三角洲表面鹽層泥土耐鹽真菌Cladosporium cladosporioides OUCMDZ-2713的發(fā)酵液中分離胞外多糖,采用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析及Sephacryl S-100凝膠滲透柱層析對多糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化,得到多糖組分Ms4-1。高效凝膠滲透色譜(HPGPC)和PMP柱前衍生高效液相色譜(HPLC)分析表明,Ms4-1的分子量為19.8 kDa,單糖組成為Man、GlcN、 GlcUA、GalNAc、Glc和Gal,其摩爾比為0.4：0.4：1.0：1.5：2.0：0.2。通過部分酸水解、甲基化分析、核磁共振波譜(1D,2D NMR)和質(zhì)譜(ESI-MS, ESI-CID-MS/MS)分析表明,Ms4-1主鏈主要由→3)-β-D-G1cpUA(1→、→4)-β-D-GlcpUA(1→和→3)-α-D-GalpNAc(1→組成的五糖核心結(jié)構(gòu)和Glc長鏈組成,由Glc組成的長鏈連接于五糖核心結(jié)構(gòu)中→3)-β-D-GlcpUA(1→的C-3上,Glc長鏈由→4)-α-D-Glcp(1→組成。體外抗氧化活性測定表明,Ms4-1清除DPPH自由基,超氧陰離子自由基和羥自由基活性的能力高,EC50值分別為1.06 mg/mL、0.21mg/mL和0.58 mg/mL。這是首次從耐鹽真菌Cladosporium cladosporioides中獲得結(jié)構(gòu)新穎且具有強(qiáng)抗氧化活性的雜多糖,為“海洋糖庫”提供了新穎特征的海洋胞外多糖。2.從廣西潿洲島紅樹林根泥真菌Aspergillus versicolor PJX-9的發(fā)酵液中分離胞外多糖,采用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析及Sephacyl S-100凝膠滲透柱層析對多糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化,得到兩個多糖組分Pwl-1和Ps1-1。HPGPC分析表明,Pwl-1和Ps1-1的分子量分別為12.3 kDa和13.6 kDa; HPLC分析表明,Pwl-1和Psl-1單糖組成相似,主要由Man組成,還有少量的Glc和Gal,摩爾比分別為9.3：1.3：1.0和6.4：1.1：2.1。甲基化分析表明,Pwl-1主要含有(1→2)-Manp,還有少最(1→6)-Manp.(1→6)-Glcp.(1→2,6)-Manp及未端Manp和Galf。體外抗氧化活性測定表明,Pw1-1清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的EC50分別為3.39 mg/mL、1.50 mg/mL和1.72 mg/mL。3.從山東東營黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)香蒲共生真菌A-154的發(fā)酵液中分離胞外多糖,通過Q Sepharose Fast Flow陰離了交換柱層析及Sephacyl S-100凝膠滲透柱層析純化得到兩個多糖組分Awl-1和Asl-1。HPGPC分析表明,Awl-1和Asl-1分子量分別為11.7 kDa和6.6 kDa: HPLC分析表明,Awl-1含有Man和Gal,其摩爾比為14.1：1.0。甲基化分析表明Awl-1主要含有Manp(1→、 (1→6)-Manp和(1→2,3)-Manp,還有少量Galf(1→及(1→2)-Manp.體外抗氧化活性測定表明,Awl-1具有較強(qiáng)的清除自由基能力,對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除EC50值分別為3.0 mg/mL、1.21 mg/mL和1.50mg/mL。4.從南海文昌霞場紅樹林共附生真菌A spergillus sp.FJ-6的發(fā)酵液中分離胞外多糖,通過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析及Sephacyl S-100凝膠滲透柱層析純化得到四個多糖組分Fwl-1、Fs1-1、Fs2-1和Fs3-1,分子量分別為11.9 kDa、17.2 kDa、16.4 kDa和18.2 kDa。Fw1-1的單糖組成為Man、Glc和Gal,摩爾比為5.2：1.4：1.0。甲基化分析表明,Fwl-1含有大量(1→2)-Manp、(1→4)-Glcp和(1→2,3)-Manp,少量(1→6)-Manp、Manp(1→、Galf(1→和微量Glcp(1→。大量(1→2,3)-Manp的存在表明Fwl-1是高分支結(jié)構(gòu),分支點(diǎn)位于(1→2)-Manp的C-3位,Fwl-1結(jié)構(gòu)新穎,在海洋真菌中少見。體外抗氧化活性測定表明,Fwl-1具有較強(qiáng)的清除自由基能力,對DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除EC50值分別為3.60 mg/mL、1.21 mg/mL和1.64 mg/mL。本論文的研究成果為我國“海洋糖庫”提供了結(jié)構(gòu)新穎和抗氧化活性的海洋微生物胞外多糖,為發(fā)掘新穎的海洋微生物胞外多糖資源提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：海洋微生物 胞外多糖 結(jié)構(gòu) 抗氧化活性
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-17
• 前言17-36
• 1 微生物多糖研究概況18-24
• 1.1 微生物多糖的分類18-19
• 1.2 微生物多糖的合成19-23
• 1.2.1 微生物多糖的合成機(jī)制19-21
• 1.2.2 微生物多糖的合成基因21-23
• 1.3 生物信息學(xué)對多糖結(jié)構(gòu)解析的作用23-24
• 2 海洋微生物胞外多糖的研究24-31
• 2.1 海洋微生物胞外多糖概況24-25
• 2.1.1 海洋微生物胞外多糖的化學(xué)組成24-25
• 2.1.2 海洋微生物胞外多糖的合成25
• 2.2 產(chǎn)胞外多糖的海洋微生物資源25-28
• 2.3 海洋微生物發(fā)酵策略28-31
• 2.3.1 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化28-30
• 2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成本的降低30-31
• 2.3.3 統(tǒng)計工具的應(yīng)用31
• 3 多糖的結(jié)構(gòu)研究技術(shù)31-35
• 3.1 酸水解32
• 3.2 高效液相色譜(HPLC)分析32-33
• 3.3 紅外光譜(IR)分析33
• 3.4 甲基化分析33-34
• 3.5 質(zhì)譜(MS)分析34
• 3.6 核磁共振(NMR)分析34-35
• 4 本課題的研究背景和意義35-36
• 第一章 黃河三角洲耐鹽真菌Cladosporium cladosporioidesOUCMDZ-2713胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究36-80
• 1 引言36
• 2 材料與儀器36-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)原料36-37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑37
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 3 實(shí)驗(yàn)方法38-48
• 3.1 胞外多糖的提取38
• 3.2 胞外多糖的分離純化38-39
• 3.2.1 離子交換柱層析38-39
• 3.2.2 凝膠滲透柱層析39
• 3.3 純度分析及分子量測定39
• 3.4 單糖組成分析39-40
• 3.4.1 多糖的完全酸水解40
• 3.4.2 PMP柱前衍生40
• 3.4.3 HPLC色譜分析40
• 3.5 理化性質(zhì)分析40-43
• 3.5.1 總糖含量的測定40-41
• 3.5.2 蛋白質(zhì)含量的測定41
• 3.5.3 糖醛酸含量的測定41-42
• 3.5.4 硫酸根含量測定42-43
• 3.6 紅外光譜(IR)分析43
• 3.7 部分酸水解43
• 3.8 糖醛酸還原43-44
• 3.9 甲基化分析44-45
• 3.9.1 試劑的處理44
• 3.9.2 甲基化反應(yīng)44-45
• 3.9.3 完全酸水解45
• 3.9.4 水解產(chǎn)物的還原45
• 3.9.5 還原樣品的乙酰化45
• 3.9.6 GC-MS分析45
• 3.10 寡糖的制備45-46
• 3.10.1 寡糖降解條件的摸索45-46
• 3.10.2 寡糖的分離純化46
• 3.10.3 寡糖的單糖組成分析46
• 3.10.4 寡糖的質(zhì)譜分析46
• 3.11 核磁共振(NMR)分析46-47
• 3.12 體外抗氧化活性測定47-48
• 3.12.1 DPPH自由基清除活性的測定47
• 3.12.2 超氧陰離子自由基清除活性的測定47-48
• 3.12.3 羥基自由基清除活性的測定48
• 4 結(jié)果與討論48-78
• 4.1 胞外多糖的分離純化48-50
• 4.1.1 離子交換柱層析48-49
• 4.1.2 凝膠滲透柱層析49-50
• 4.2 純度分析及分子量測定50-51
• 4.3 單糖組成分析51-52
• 4.4 理化性質(zhì)分析52-53
• 4.5 紅外光譜分析53-54
• 4.6 部分酸水解54-55
• 4.7 糖醛酸還原55
• 4.8 甲基化分析55-61
• 4.8.1 甲基化原理55-57
• 4.8.2 Ms4-1P的甲基化分析57-59
• 4.8.3 Ms4-1PR的甲基化分析59-61
• 4.9 寡糖的制備61-69
• 4.9.1 寡糖降解條件的摸索61
• 4.9.2 寡糖的純化61-62
• 4.9.3 寡糖的單糖組成測定62-63
• 4.9.4 寡糖的ESI-CID-MS分析63
• 4.9.5 寡糖的ESI-CID-MS/MS分析63-69
• 4.9.5.1 二糖片段F2-2的ESI-CID-MS/MS分析64-66
• 4.9.5.2 三糖片段F2-1的ESI-CID-MS/MS分析66
• 4.9.5.3 四糖片段F1-1的ESI-CID-MS/MS分析66-67
• 4.9.5.4 七糖片段F0-2的ESI-CID-MS/MS分析67-68
• 4.9.5.5 八糖片段F0-1的ESI-CID-MS/MS分析68-69
• 4.10 核磁共振波譜分析69-76
• 4.11 抗氧化活性測定76-78
• 5 本章小結(jié)78-80
• 第二章 紅樹林根泥真菌Aspergillus versiolor PJX-9胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究80-95
• 1 引言80
• 2 材料與儀器80-81
• 2.1 實(shí)驗(yàn)原料80-81
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑81
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器81
• 3 實(shí)驗(yàn)方法81-82
• 3.1 胞外多糖的提取81
• 3.2 胞外多糖的分離純化81
• 3.3 純度分析及分子量測定81
• 3.4 單糖組成分析81-82
• 3.5 理化性質(zhì)分析82
• 3.6 紅外光譜分析82
• 3.7 甲基化分析82
• 3.8 抗氧化活性測定82
• 4 結(jié)果與討論82-94
• 4.1 胞外多糖的分離純化82-84
• 4.1.1 離子交換柱層析82-83
• 4.1.2 凝膠滲透柱層析83-84
• 4.2 純度分析及分子量測定84-85
• 4.3 單糖組成分析85-86
• 4.4 理化性質(zhì)分析86-87
• 4.5 紅外光譜分析87
• 4.6 甲基化分析87-92
• 4.7 抗氧化活性測定92-94
• 5 本章小結(jié)94-95
• 第三章 黃河三角洲香蒲共生真菌A-154胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究95-107
• 1 引言95
• 2 材料與儀器95-96
• 2.1 實(shí)驗(yàn)原料95-96
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑96
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器96
• 3 實(shí)驗(yàn)方法96-97
• 3.1 胞外多糖的提取96
• 3.2 胞外多糖的分離純化96
• 3.3 純度分析及分子量測定96
• 3.4 單糖組成分析96
• 3.5 理化性質(zhì)分析96-97
• 3.6 紅外光譜分析97
• 3.7 甲基化分析97
• 3.8 抗氧化活性測定97
• 4 結(jié)果與討論97-106
• 4.1 胞外多糖的分離純化97-99
• 4.1.1 離子交換柱層析97-98
• 4.1.2 凝膠滲透柱層析98-99
• 4.2 純度分析及分子量測定99-100
• 4.3 單糖組成分析100-101
• 4.4 理化性質(zhì)分析101
• 4.5 紅外光譜分析101-102
• 4.6 甲基化分析102-104
• 4.7 抗氧化活性測定104-106
• 5 本章小結(jié)106-107
• 第四章 紅樹林共附生真菌Aspergillus sp.FJ-6胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究107-122
• 1 引言107
• 2 材料與儀器107-108
• 2.1 實(shí)驗(yàn)原料107-108
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑108
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器108
• 3 實(shí)驗(yàn)方法108-109
• 3.1 胞外多糖的提取108
• 3.2 胞外多糖的分離純化108
• 3.3 純度分析及分子量測定108
• 3.4 單糖組成分析108
• 3.5 理化性質(zhì)分析108-109
• 3.6 紅外光譜分析109
• 3.7 甲基化分析109
• 3.8 抗氧化活性測定109
• 4 結(jié)果與討論109-120
• 4.1 胞外多糖的分離純化109-112
• 4.1.1 離子交換柱層析109-110
• 4.1.2 凝膠滲透柱層析110-112
• 4.2 純度分析及分子量測定112-113
• 4.3 單糖組成分析113-115
• 4.4 理化性質(zhì)分析115
• 4.5 紅外光譜分析115-116
• 4.6 甲基化分析116-119
• 4.7 抗氧化活性測定119-120
• 5 本章小結(jié)120-122
• 參考文獻(xiàn)122-134
• 結(jié)語134-137
• 致謝137-138
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文138-139
• 個人簡歷139

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