發(fā)布時(shí)間：2017-05-03 23:10

  本文關(guān)鍵詞：樹(shù)突狀細(xì)胞在Lmdd-MPFG疫苗抗腫瘤作用中的免疫調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型,由于其有限的治療手段,死亡率在惡性腫瘤中居第三位。人們一直努力地探尋著預(yù)防和治療HCC的可行方案,現(xiàn)如今,腫瘤的免疫治療逐漸成為肝癌研究的熱點(diǎn),例如疫苗的研制以及相關(guān)免疫細(xì)胞治療等。減毒李斯特菌因其感染細(xì)胞后胞內(nèi)寄生以及可被清除等特性,已成為腫瘤疫苗載體的理想開(kāi)發(fā)對(duì)象。在前期研究中,我們通過(guò)一種減毒的李斯特菌Lmdd,利用重組PCR的方法,將肝癌相關(guān)融合基因同源重組至該菌中,構(gòu)建了重組減毒李斯特菌肝癌疫苗Lmdd-MPFG(LM)。并且證實(shí)了該疫苗可以誘發(fā)特異性抗HCC細(xì)胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生,具有一定的抑瘤效應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)目前已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞—樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)在LM疫苗發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的過(guò)程中也扮演著重要的角色。然而,DC在LM感染后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫效應(yīng)中是否具有重要的調(diào)控地位,以及可能存在的關(guān)鍵性免疫機(jī)制,尚不明確。因此,在本研究中,我們著重探討了DC在LM感染過(guò)程中激發(fā)抗HCC效應(yīng)中的免疫調(diào)控作用,同時(shí)明確了DC的模式識(shí)別受體及其介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在此過(guò)程中的具體機(jī)制,為進(jìn)一步闡明肝癌的致病機(jī)制及免疫治療提供新的理論依據(jù)。本課題中,我們首先觀察了體外LM-MPFG疫苗刺激誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟活化的情況。在體外成功分離誘導(dǎo)出小鼠骨髓來(lái)源未成熟DC的基礎(chǔ)上,分別用LPS,野生型Lm(WT),Lmdd-MPFG(LM)以及相應(yīng)菌株的熱滅活細(xì)菌刺激未成熟DC。收集刺激后各組細(xì)胞以及培養(yǎng)上清,分別利用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)了刺激后DC表型及細(xì)胞因子分泌的變化情況。另外在將刺激前后DC與同體的T細(xì)胞共培養(yǎng)后,還通過(guò)了3H摻入法以及ELISPOT分別檢測(cè)了lm介導(dǎo)dc對(duì)t細(xì)胞增殖及特異性t細(xì)胞生成的影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)重組lmdd-mpfg體外可有效刺激dc的功能活化,刺激后dc的cd80及cd86表達(dá)均明顯上調(diào),并且dc在lm刺激后細(xì)胞因子的分泌也增多。同時(shí)在體外,lm誘導(dǎo)dc活化后也可進(jìn)一步成功誘導(dǎo)功能性t細(xì)胞增殖,促進(jìn)抗原特異性ctl反應(yīng)的產(chǎn)生。為明確上述現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制,本課題還收集了刺激后dc,在mrna以及蛋白水平上篩選和驗(yàn)證了相關(guān)tlrs以及nlrs的表達(dá)變化情況,并對(duì)篩選出的關(guān)聯(lián)性受體下游的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了探索。結(jié)果證實(shí)相關(guān)模式識(shí)別受體如nod1,nlrp3以及tlr4在lm刺激dc成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,且主要依賴(lài)于nf-kb以及caspase-1相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。進(jìn)一步以這些dc表達(dá)受體作為研究對(duì)象,在激動(dòng)或干擾相應(yīng)受體后,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)lm刺激后dc的表型變化,elisa檢測(cè)細(xì)胞因子分泌情況,最后在蛋白水平對(duì)這些信號(hào)分子的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)nod1/nod2,nlrp3以及tlr4在lm誘導(dǎo)dc活化過(guò)程中均表達(dá)上調(diào),并且這些相關(guān)受體主要通過(guò)nf-kb以及caspase-1下游信號(hào)通路發(fā)揮主要的調(diào)控功能。同時(shí)lm感染時(shí)激動(dòng)和干擾這些受體均可引起dc相應(yīng)的表型功能變化,而nod1/nod2,tlr4和nlrp3也被證明在lm誘導(dǎo)dc活化過(guò)程中具有的交叉遞呈的現(xiàn)象,更好地明確了機(jī)制。同時(shí)本課題還開(kāi)展了一系列的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),來(lái)進(jìn)一步探究lm免疫后dc對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。首先我們建立了皮下腫瘤模型,隨后分別尾靜脈注射lm,dc聯(lián)合lm,sinlrp3dc聯(lián)合lm以及pbs對(duì)照,對(duì)腫瘤小鼠進(jìn)行分組免疫。期間分析各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)大小及生存期發(fā)現(xiàn),lm,尤其在聯(lián)合dc后,對(duì)腫瘤具有很好的免疫抑制效應(yīng),而dc中nlrp3的缺失會(huì)導(dǎo)致抑瘤功能減弱。另外通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫腫瘤小鼠脾臟及腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn),聯(lián)合dc和lm免疫后,可增強(qiáng)脾臟內(nèi)的特異性免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),且腫瘤內(nèi)小鼠特異性t細(xì)胞數(shù)目增多。同時(shí),dc可以通過(guò)增強(qiáng)lm引起的特異性ctl反應(yīng),改變t細(xì)胞分群,特別是通過(guò)il-17a-cd4+t細(xì)胞的增多來(lái)發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。最后我們還驗(yàn)證了在HCC患者腫瘤組織中存在著明顯的DC缺陷現(xiàn)象而HCC患者外周血中DC也存在著功能的缺陷,同樣在人體內(nèi),LM也能通過(guò)刺激DC相關(guān)NLR及TLR的活化,發(fā)揮抑瘤效果。綜上所述,本研究證實(shí)了DC介導(dǎo)的LM疫苗具有抑制腫瘤效應(yīng),其中NOD1,NLRP3以及TLR4等模式識(shí)別受體及其下游交叉信號(hào)發(fā)揮著主要的調(diào)控作用。該現(xiàn)象和機(jī)制的提出為新型聯(lián)合疫苗的研制開(kāi)發(fā)提供了可靠的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：李斯特菌疫苗 肝細(xì)胞肝癌 樹(shù)突狀細(xì)胞 模式識(shí)別受體
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R730.51
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-18
• 參考文獻(xiàn)14-18
• 第一部分 李斯特菌減毒疫苗Lmdd-MPFG體外促進(jìn)BMDCs成熟并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答18-32
• 1.1 材料與方法18-25
• 1.2 結(jié)果25-27
• 1.3 討論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• 第二部分 相關(guān)NLRs及其與TLRs交叉免疫信號(hào)通路在LM疫苗活化DC過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制研究32-48
• 2.1 材料與方法32-40
• 2.2 結(jié)果40-44
• 2.3 討論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 第三部分 腫瘤免疫接種小鼠模型的構(gòu)建和體內(nèi)DC促進(jìn)LM疫苗抑瘤效應(yīng)的研究48-63
• 3.1 材料與方法48-55
• 3.2 結(jié)果55-61
• 3.3 討論61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 第四部分 驗(yàn)證HCC患者DC的功能缺陷及相關(guān)受體對(duì)LM免疫應(yīng)答的影響情況63-71
• 4.1 材料與方法63-68
• 4.2 結(jié)果68-69
• 4.3 討論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-71
• 小結(jié)71-72
• 文獻(xiàn)綜述72-83
• 參考文獻(xiàn)77-83
• 縮略語(yǔ)表83-84
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文84-85
• 致謝85

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本文編號(hào)：343943