目的:癌癥是全球疾病導(dǎo)致死亡的主要原因,嚴(yán)重危害著人類的生命健康。雖然隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)與科技的不斷發(fā)展,各種檢測(cè)和治療手段層出不窮,但癌癥的死亡率卻沒有顯著的下降,主要原因是腫瘤極易復(fù)發(fā),以及相關(guān)治療藥物的副作用較大。因此尋找新的毒性小甚或無毒副作用的腫瘤治療藥物十分重要。姜科植物土田七是一味民族藥,在廣西少數(shù)民族地區(qū)使用,常用于治療跌打損傷,風(fēng)濕骨痛,月經(jīng)過多、外傷出血及蛇蟲咬傷等;已有研究表明,該藥具有良好的抗腫瘤效果,其所含化學(xué)成分能夠殺傷肝癌細(xì)胞。本課題擬采用中藥化學(xué)分離、純化與藥理實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,篩選出土田七抗腫瘤的活性物質(zhì),并闡明其作用機(jī)制。方法:1土田七的總提取物及其分離純化1.1研究土田七的提取方法,探討不同因素對(duì)土田七提取率的影響。1.2對(duì)土田七總提取物利用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化,得到不同的洗脫部位。利用細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和荷瘤小鼠對(duì)各洗脫部位進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)估。選取活性最優(yōu)的洗脫部位,再利用硅膠柱層析法進(jìn)行分離純化,并進(jìn)行體外抗肝癌活性篩選。2土田七活性部位抗腫瘤藥理作用機(jī)制的研究2.1利用不同給藥濃度處理肝癌細(xì)胞,通過Western-blot檢測(cè)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋... 

【文章來源】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

姜科植物抗腫瘤篩選

土田七抗腫瘤作用及其機(jī)制研究11的增殖抑制率。4.4.2不同濃度乙醇洗脫部位抑制肝癌細(xì)胞增殖的結(jié)果用各洗脫部位對(duì)肝癌H22細(xì)胞進(jìn)行處理，測(cè)定其細(xì)胞增殖抑制率。由圖2可知，水洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞并無明顯的增殖抑制作用，30%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用，70%乙醇洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用最為明顯。另外，當(dāng)濃度超過40μg/mL，70%乙醇洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，且藥物濃度越高，抑制作用越明顯。各洗脫部位相比較，IC50顯示70%乙醇洗脫部位相對(duì)于其它組對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制的濃度-抑制率曲線具有顯著性差異(P＜0.05)。圖2大孔樹脂不同洗脫部位抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用4.4.3不同濃度的乙醇洗脫部位誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長期的肝癌H22細(xì)胞進(jìn)行離心，棄掉上清液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。6孔板中每孔加入2mL細(xì)胞懸液，放入37oC培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h。分別向各孔中加入不同濃度(濃度分別為：20、40、60、80、100μg/mL)的30%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位及95%乙醇洗脫部位，對(duì)照組加入等體積的生理鹽水(含DMSO)，在培養(yǎng)箱中處理24h。分別吸取各組上清液于離心管中，將胰蛋白酶消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至各離心管中，進(jìn)行離心(800rpm/min、5min)，吸取上清液，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，洗滌2次。按照試劑盒操作步驟，加入AnnexinV-FITC和PI染液，充分混勻后，避光染色半小時(shí)。檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。4.4.4不同濃度乙醇洗脫部位誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果用各洗脫部位對(duì)肝癌H22細(xì)胞進(jìn)行處理，測(cè)定其細(xì)胞凋亡率。由圖3

湖北中醫(yī)藥大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文12可知，70%乙醇洗脫部位誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)，30%乙醇洗脫部位及95%乙醇洗脫部位作用次之。且隨著各乙醇洗脫部位濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率也隨之增高。此外，當(dāng)濃度為20、40、60μg/mL，70%乙醇洗脫部位與其他洗脫部位相比較，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。當(dāng)濃度為80、100μg/mL，70%乙醇洗脫部位與其他洗脫部位相比，它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用具有非常顯著的差異(P＜0.01)。圖3大孔樹脂柱各洗脫部位對(duì)肝癌H22細(xì)胞凋亡的作用4.4.5討論本課題采用CCK-8法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定，而沒有選擇傳統(tǒng)的MTT法，這是因?yàn)镃CK-8法具有靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)、操作方便、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等一系列優(yōu)點(diǎn)。CCK-8的原理是其中含有的WST-8被氧化還原，從而生成黃色的甲臜染料，其生成的甲臜染料數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。根據(jù)體外藥理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，可以確認(rèn)70%洗脫部位效果最佳。4.5不同濃度的乙醇洗脫部位體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.5.1細(xì)胞株來源肝癌細(xì)胞株H22(鼠源性；腹水型肝癌細(xì)胞株),購自于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。4.5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源昆明小鼠(雌性，4-6周；體重20-22g)，購自于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。4.5.3實(shí)驗(yàn)方法25只4-6周齡的小鼠右腿外側(cè)接種H22細(xì)胞，2×105/只。7天后，將25只小鼠隨機(jī)分成5組，為生理鹽水組、水洗脫部位組、30%乙醇洗脫

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3438622