研究背景和目的血管鈣化（Vascular calcification）作為心血管事件的獨立危險因素廣泛存在于慢性腎臟病及糖尿病患者中,是該疾病人群心血管事件高發(fā)的重要因素之一。外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）是一種II型跨膜糖蛋白,通過水解生成焦磷酸（PPi）,在軟組織異位鈣化中起重要作用,但是其在慢性腎臟病及糖尿病患者的血管鈣化發(fā)生過程中是否起作用仍不清楚。終末期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation end products,AGEs）作為兩者疾病均廣泛存在的一種毒素,可能在血管鈣化中扮演了重要角色。本研究旨在了解AGEs在誘導血管鈣化過程中與ENPP1的相互作用關系,以進一步探討血管鈣化的發(fā)生機制。方法（1）通過高糖加牛血清白蛋白的方法孵育AGEs,并用CCK-8試劑盒檢測AGEs對體外培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞系（human aortic smooth muscle cells,HASMCs）的細胞活力的影響。（2）將HASMCs用β-GP單獨或者在AGE... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

1孵育90天后的BSA（左）及AGEs（右）

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文19充分震蕩混勻，離心之后上機，程序如下：圖2.4.4.2PCR程序圖Figure2.4.4.2ThePCRprogramdiagram反應結(jié)束后，使用BioRadCFXManager軟件進行數(shù)據(jù)分析。2.5Westernblot分析2.5.1細胞總蛋白提�。�1）各組細胞在完成處理后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS潤洗3次；（2）配制細胞裂解液（RIPA:PMSF=100:1）;（3）吸干培養(yǎng)皿中殘余液體，將裂解液均勻的滴加在培養(yǎng)皿中，晃動培養(yǎng)皿，使裂解液與細胞充分接觸，冰上裂解10min；（4）將細胞及裂解液用細胞刮刮下，轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲裂解10次；（5）4℃、12000×g低溫離心20min；（6）棄去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，取少量用于蛋白濃度測定，其余-80℃保存待用。2.5.2蛋白濃度測定（BCA法）（1）取部分蛋白標準品稀釋至工作濃度（0.5mg/ml）；

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文23通過CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測了不同濃度AGEs對HASMCs的細胞活性的影響。分別以0、50、100、200、400和800μg/ml濃度的AGEs和10μM的β-GP處理HASMCs細胞24、48及72h，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)50-800μg/ml濃度的AGEs對HASMCs細胞活力無明顯影響（圖3.1）。根據(jù)文獻，本研究選用200μg/ml濃度的AGEs作為后續(xù)實驗處理濃度。圖3.1AGEs對HASMCs的細胞活力影響Figure3.1EffectsofAGEsoncellviabilityofHASMCs.3.2AGEs協(xié)同高磷誘導HASMCs成骨轉(zhuǎn)分化為探究AGEs對HASMCs成骨轉(zhuǎn)分化情況的影響，本研究采用200μg/ml濃度的AGEs在鈣化培養(yǎng)情況下（10mMβ-GP）處理HASMCs細胞24小時，RT-qPCR結(jié)果顯示高磷使HASMCs細胞中RUNX2及BMP2的表達升高，而在AGEs與高磷共同作用組中RUNX2及BMP2進一步表達升高（圖3.2a-b）。進一步在相同條件下處理HASMCs細胞7天后，westernblot結(jié)果也提示AGEs可以使HASMCs細胞中RUNX2及BMP2的表達明顯升高（圖3.2c-e）。這些結(jié)果提示AGEs可以協(xié)同高磷促進HASMCs細胞的成骨轉(zhuǎn)分化。


本文編號：3421528