發(fā)布時間：2021-08-22 04:22

　　目的:探究在肝細胞肝癌中circSP3的表達、作用以及circSP3通過作為miR-198海綿調(diào)節(jié)CDK4的表達從而促進肝細胞癌的增殖、遷移和侵襲的相關(guān)機制。方法:采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗檢測circSP3在肝細胞癌患者癌組織和癌旁肝組織中的表達水平,此外檢測4種肝癌細胞（Hep-3B、Huh7、Bel-7402、SMMC-7721）和正常肝細胞（HL-77O2）中的表達水平。使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及慢病毒感染Hep-3B和Huh-7細胞,從而篩選得到過表達以及敲低circSP3表達的肝癌細胞株。同時采用CCK-8實驗,Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗分別檢測circSP3對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。采用裸鼠成瘤實驗來驗證circSP3在體內(nèi)對細胞增殖活性的影響。然后使用生物信息學分析,qRT-PCR,雙熒光素酶測定和蛋白質(zhì)印跡分析circSP3,miR-198和CDK4之間的關(guān)系。之后的救援實驗驗證circSP3通過作為miR-198海綿調(diào)節(jié)CDK4的表達從而促進肝細胞癌的增殖、遷移和侵襲。結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果表明,相比與癌旁肝組織和正常肝... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

circSP3在HCC組織中的表達水平Figure1.RelativeexpressionofcircSP3inHCCtissues.qRT-PCR檢測50對HCC組織和對應(yīng)癌旁肝組織中circSP3的表達水平

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文282.2circSP3環(huán)狀結(jié)構(gòu)確定通過Sanger測序，數(shù)據(jù)庫查詢和RNaseR處理確認circSP3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。CircSP3（chr2：174,819,600–174,820,960）源自SP3基因座中的外顯子區(qū)域，該區(qū)域位于染色體2q31.1（圖2A）上。為了確認circSP3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，我們首先將circSP3的PCR產(chǎn)物插入T載體進行Sanger測序。如圖2B所示，測序結(jié)果與circBase提供的circSP3的反向剪接區(qū)域一致。另外，我們設(shè)計了兩組引物，一組用于環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的引物，另一組用于線性轉(zhuǎn)錄本的引物。然后，我們將circRNA敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，并使用RTPCR檢測SP3的環(huán)狀和線性轉(zhuǎn)錄表達水平。結(jié)果表明，circSP3水平顯著降低，而SP3線性轉(zhuǎn)錄本的表達水平?jīng)]有變化（圖2C）。最后，對RNA進行RNaseR核酸外切酶的消化抗性實驗。結(jié)果表明，使用RNaseR核酸外切酶處理之后線性SP3表達水平被明顯降低，而circSP3的表達水平?jīng)]有明顯變化（圖2D）�？傮w而言，實驗結(jié)果證明了circSP3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。圖2.circSP3環(huán)狀結(jié)構(gòu)確定Figure2.ConfirmationofcircularstructureofcircSP3A,B.Sange測序以及數(shù)據(jù)庫查詢驗證circSP3的位置以及環(huán)化位點。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文29C,D.qRT-PCR檢測circSP3敲低以及RnaseR處理后線性SP3和circSP3的表達。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。A,B.SangesequencinganddatabasequeryverifythepositionofcircSP3andthecircularizationsite.C,D.qRT-PCRwasusedtodetectcircSP3knockdownandlinearSP3andcircSP3expressionafterRnaseRtreatment.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.2.3circSP3在HCC細胞中的表達采用qRT-PCR對4種HCC細胞(Hep-3B,Huh7,Bel-7402和SMMC-7721)和正常肝細胞(HL-77O2)中circSP3的表達水平進行檢測。結(jié)果表明，同正常肝細胞相比，4種HCC細胞中circSP3的表達水平均顯著上調(diào)；相對于正常肝細胞，Hep-3B（P<0.05）,SMMC-7721（P<0.001）,Bel-7402（P<0.001）和Huh7（P<0.001）,中circSP3的表達量分別為：1.440±0.1286,1.603±0.05783,1.637±0.03180,2.222±0.1931。4種HCC細胞中，Huh-7細胞中circSP3的表達水平最高，而Hep-3B細胞中circSP3的表達水平最低。因此選用Hep-3B細胞和Huh-7細胞作為后續(xù)實驗對象。圖3.circSP3在HCC細胞中的表達水平Figure3.ExpressionofcircSP3inHCCcelllines.qRT-PCR檢測4種HCC細胞(Hep-3B,Huh7,Bel-7402和SMMC-7721)和正常肝細胞(HL-77O2)中circSP3的表達水平。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。RelativecircSP3expressionlevelsinfiveHCCcelllines(Hep-3B,Huh7,SMMC-7721andBel-7402)andonenormalhumanhepatocyte(HL-7702)wasdetectedbyqRT-PCR.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.


本文編號：3356993