本文關(guān)鍵詞：ANXA3調(diào)控小鼠肝癌細(xì)胞惡性表型分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3,ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一,是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,有36 k Da和33 k Da兩種亞型,其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細(xì)胞遺傳背景相似但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同,ANXA3在Hca-F和Hca-P細(xì)胞株中均高豐度表達(dá)但又有差異,是研究ANXA3與肝癌腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的理想模型。目的:1、構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F和Hca-P細(xì)胞,篩選ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的Hca-F和Hca-P單克隆細(xì)胞株;2、構(gòu)建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并在Hca-P細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ANXA3;3、考察ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-F細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲的影響;4、考察ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移、侵襲及耐藥性的影響;5、研究ANXA3的亞細(xì)胞定位;6、考察ANXA3過(guò)表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響;7、系統(tǒng)研究ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細(xì)胞惡性表型的分子調(diào)控機(jī)制。方法:1、利用在線軟件設(shè)計(jì)Anxa3基因的sh RNA及無(wú)關(guān)序列(NC,陰性對(duì)照),構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3及p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達(dá)載體;2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至Hca-F和Hca-P細(xì)胞,G418抗性篩選及有限稀釋法獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株,計(jì)算ANXA3下調(diào)效率;3、自行設(shè)計(jì)引物,利用基因工程方法構(gòu)建p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3過(guò)表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hca-P細(xì)胞;4、CCK-8法分析ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-F和Hca-P細(xì)胞,ANXA3過(guò)表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞增殖能力的影響;軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)考察ANXA3下調(diào)及過(guò)表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室法分析ANXA3的表達(dá)對(duì)Hca-F和Hca-P細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;6、CCK-8結(jié)合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞耐藥性及抗順鉑誘導(dǎo)凋亡的影響;7、激光掃描共聚焦實(shí)驗(yàn)確定ANXA3蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位;8、Western Blot確定ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細(xì)胞惡性行為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子水平變化。結(jié)果:1、成功構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC表達(dá)載體,獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的F-ANXA3-sh RNA、P-ANXA3-sh RNA1和P-ANXA3-sh RNA2單克隆細(xì)胞株;2、酶切及測(cè)序結(jié)果表明,p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功;3、F-ANXA3-sh RNA細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力分別是陰性對(duì)照組的1.62、1.59和2.98倍,ANXA3下調(diào)通過(guò)激活Erk通路和PI3K/Akt通路增強(qiáng)Hca-F細(xì)胞的惡性表型;4、P-ANXA3-sh RNA1(2)細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別是陰性對(duì)照組的1.13(1.08)、4.06(4.86)、4.98(4.75)和2(2.77)倍,ANXA3下調(diào)通過(guò)激活Erk和JNK通路增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞的惡性表型;5、ANXA3過(guò)表達(dá)后,陰性對(duì)照組細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別提升為上調(diào)組的1.19、1.32、2.92和3.4倍,ANXA3的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制Erk和JNK通路來(lái)抑制Hca-P細(xì)胞的惡性表型;6、激光掃描共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA3蛋白表達(dá)主要集中于細(xì)胞質(zhì)中;7、ANXA3下調(diào)增強(qiáng)了Hca-P細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,對(duì)5-FU耐藥性無(wú)明顯影響,ANXA3通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑調(diào)控Hca-P細(xì)胞的cisplatin的耐藥性。結(jié)論:1、p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa3/NC、p EGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達(dá)載體成功構(gòu)建;2、獲得了ANXA3表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株;3、ANXA3的下調(diào)通過(guò)激活Erk通路和PI3K/Akt通路促進(jìn)Hca-F細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲惡性表型;4、ANXA3的下調(diào)增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,相反,ANXA3的過(guò)表達(dá)抑制Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,主要通過(guò)調(diào)控Erk和JNK通路來(lái)實(shí)現(xiàn);5、ANXA3蛋白表達(dá)主要集中于細(xì)胞質(zhì)中;6、ANXA3下調(diào)通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑來(lái)提高Hca-P細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性。
【關(guān)鍵詞】：ANXA3 肝癌 Hca-F Hca-P 增殖 遷移 侵襲 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分: ANXA3表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞惡性表型及分子機(jī)制研究16-38
• 一、ANXA3表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞株的建立16-23
• 材料和方法16-20
• 結(jié)果20-22
• 討論22-23
• 結(jié)論23
• 二、ANXA3對(duì)Hca-F細(xì)胞惡性表型的影響及分子機(jī)制研究23-34
• 材料和方法23-27
• 結(jié)果27-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-38
• 第二部分: ANXA3表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞惡性表型及分子機(jī)制研究38-60
• 一、ANXA3表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞株的建立38-44
• 材料和方法38-40
• 結(jié)果40-43
• 討論43
• 結(jié)論43-44
• 二、ANXA3對(duì)Hca-P細(xì)胞惡性表型的影響及分子機(jī)制研究44-57
• 材料和方法44-47
• 結(jié)果47-54
• 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 第三部分:ANXA3表達(dá)上調(diào)降低Hca-P細(xì)胞惡性表型及作用機(jī)制研究60-78
• 一、構(gòu)建pEGFP-N1-Anxa3和pc DNA3.1/V5-His B-Anxa3表達(dá)質(zhì)粒60-69
• 材料和方法60-67
• 結(jié)果67-68
• 討論68-69
• 結(jié)論69
• 二、ANXA3表達(dá)上調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞惡性表型的影響及分子機(jī)制研究69-77
• 材料和方法69-71
• 結(jié)果71-76
• 討論76
• 結(jié)論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-78
• 綜述78-94
• 參考文獻(xiàn)85-94
• 致謝94-95

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉友華;薛社普;;胞質(zhì)因子對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞惡性表型和基因表達(dá)的調(diào)控作用[J];臨床血液學(xué)雜志;1988年01期

2 劉友華,薛社普;胞質(zhì)因子對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞惡性表型和基因表達(dá)的調(diào)控作用[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生物學(xué) 農(nóng)學(xué) 醫(yī)學(xué) 地學(xué));1987年08期

3 范慕貞;關(guān)鈞;吳克斌;王晉清;馮立新;;多胺生物合成抑制與腫瘤惡性表型逆轉(zhuǎn)[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2001年05期

4 呂有勇,D.G.Blair,T.Y.Shih,D.J.Clanton,S.Segal;V-ras基因點(diǎn)突變與轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性表型的研究[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1992年11期

5 張京偉;周云峰;文顯梅;魏蕾;楊國(guó)梁;;淫羊藿甙逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞惡性表型的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2006年10期

6 張立力;層粘連蛋白與腫瘤惡性表型[J];臨床內(nèi)科雜志;1998年06期

7 劉樹立;張盛;戴順東;王恩華;;肺癌中Kaiso的漿表達(dá)與人肺癌的惡性表型正相關(guān)[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2011年03期

8 范慕貞,吳克斌,關(guān)鈞,王晉清,趙成龍,曹淑蘭,陳仕明,馮立新;多胺生物合成調(diào)控與腫瘤細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1995年04期

9 宋麗華,白淑清,楊偉力,田生禮,張宏權(quán),王會(huì)信,劉及;人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性表型的抑制作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1997年05期

10 陳學(xué)良,宋麗,劉春生,叢雅琴,裴玉麗,王應(yīng)s

本文編號(hào)：335145