目的:結(jié)直腸癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均位居前三位。約50%的患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的五年生存率不足10%。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor,CAR）T細(xì)胞在治療血液癌中已取得顯著療效,但仍難以攻克實(shí)體瘤,且存在嚴(yán)重細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性等風(fēng)險(xiǎn)。自然殺傷（natural killer,NK）細(xì)胞在安全性、可及性上更優(yōu)于T細(xì)胞,因此我們擬通過(guò)使用NK細(xì)胞作為NKG2D CAR的修飾載體,評(píng)估NKG2D CAR-NK細(xì)胞用于治療結(jié)直腸癌晚期患者的安全性和可行性。方法:通過(guò)使用電穿孔的方法對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行NKG2D mRNA CAR的修飾,利用流式細(xì)胞分析檢測(cè)、IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和細(xì)胞毒性殺傷試驗(yàn)檢測(cè)NKG2D CAR-NK細(xì)胞的體外殺瘤能力。使用HCT116-luc結(jié)直腸癌細(xì)胞系構(gòu)建NSG小鼠模型,通過(guò)活體動(dòng)物成像技術(shù)和Kaplan-Meier生存分析來(lái)檢測(cè)NKG2D CAR-NK細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤效果。進(jìn)一步通過(guò)開(kāi)展一項(xiàng)單臂、開(kāi)放、劑量遞增的單中心的初期臨床研究（NCT03415100）來(lái)評(píng)估NKG2D CAR-NK細(xì)胞治... 

【文章來(lái)源】：廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

劑量爬坡設(shè)計(jì)圖

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文30圖2-1.（A）mRNACAR結(jié)構(gòu)示意圖；（B）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表面的NKG2DCAR表達(dá)水平和MFI值；（C）NKG2DpCAR表達(dá)的time-lapse分析結(jié)果圖2.NKG2DpCAR-NK細(xì)胞具有更強(qiáng)的IFN-γ分泌能力和細(xì)胞毒性將來(lái)自同一供體并在相同培養(yǎng)條件下擴(kuò)增的NK細(xì)胞分別使用等量的NKG2Dz和NKG2DpmRNACAR進(jìn)行電穿孔修飾，然后比較NKG2Dz和NKG2DpCAR-NK的體外腫瘤殺傷活性。首先通過(guò)ELISPOT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)IFN-γ的分泌水平來(lái)評(píng)價(jià)CAR-NK的IFN-γ分泌能力。使用人SKOV3卵巢癌細(xì)胞系、HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞系和Detroit562咽癌細(xì)胞系為靶細(xì)胞。將NK、CtrlCAR-NK、NKG2DpCAR-NK和NKG2DzCAR-NK分別與靶腫瘤細(xì)胞以5：1的E:T比例共培養(yǎng)過(guò)夜。NK細(xì)胞組和CtrlmRNACAR-NK細(xì)胞組作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞組與對(duì)照組相比，產(chǎn)生了更多更強(qiáng)的IFN-γ細(xì)胞因子。NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞產(chǎn)生的ELISPOT點(diǎn)顯著高于其余兩個(gè)對(duì)照組（圖2-2A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。而且NKG2DCAR-NK分別和SKOV3和Detroit562靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，結(jié)果顯示NKG2DpCAR-NK比NKG2DzCAR-NK具有更強(qiáng)的IFN-γ分泌能力。此外，我們還進(jìn)行了轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，效應(yīng)細(xì)胞與靶標(biāo)細(xì)胞的比例范圍由5：1到0.625：1，研究結(jié)果顯示當(dāng)SKOV3和Detroit細(xì)胞作為靶標(biāo)時(shí)，NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞殺傷效果在5：1靶標(biāo)比時(shí)達(dá)到60%，對(duì)比與其余兩個(gè)對(duì)照組約20%的殺傷效果，NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞明顯具有更強(qiáng)的殺傷效果（圖2-2B）。當(dāng)HCT116細(xì)胞作為靶標(biāo)時(shí)，對(duì)照組在2.5：1靶標(biāo)比時(shí)已達(dá)到30%的殺傷效果，而NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞在2.5：1靶標(biāo)比時(shí)已經(jīng)達(dá)到60-70%，進(jìn)一步說(shuō)明了NKG2DmRNACAR-NK細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺瘤活性（圖2-2B）。而且，在圖2-2B中可見(jiàn)，NKG2Dp

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文32圖2-3.（A）HCT116-luc移植荷瘤小鼠腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)變化圖；（B）HCT116-luc荷瘤小鼠生存期曲線(xiàn)二、NKG2DCAR-NK細(xì)胞過(guò)繼治療結(jié)直腸癌患者的臨床研究結(jié)果1.CAR-NK細(xì)胞過(guò)繼治療劑量爬坡設(shè)計(jì)團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了一項(xiàng)單臂、開(kāi)放、劑量遞增的臨床研究（NCT03415100），用于評(píng)估過(guò)繼輸注NKG2DmRNACAR電穿孔修飾的NK細(xì)胞用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的安全性和可行性，本研究共入組了3例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者。臨床試驗(yàn)劑量爬坡設(shè)計(jì)如圖3-1所示。第1位患者（1001）共回輸2次，劑量分別為2×107和1×108個(gè)NKG2DCAR-NK細(xì)胞，每周1次；第2位患者（1002）共回輸4次，劑量分別為1×108，3×108，5×108和7×108個(gè)NKG2DCAR-NK細(xì)胞，每周1次；第3位患者（1003）共回輸6次，劑量分別為5×108，5×108，1×109，1×109，2×109和2×109個(gè)NKG2DCAR-NK細(xì)胞，每周2次。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3273636