冷受體TRPM8是瞬時(shí)受體電位（TRP）陽(yáng)離子通道家族的成員,參與了多種人體的生理病理過(guò)程,包括疼痛轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)、溫度調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生等多種細(xì)胞功能,因此,TRPM8是重要的疼痛和癌癥的靶點(diǎn)。但是,目前人源TRPM8的結(jié)構(gòu)還未被解析,大大阻礙了人們對(duì)于TRPM8分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)和靶點(diǎn)藥物的研發(fā)。為了解析高分辨率人源TRPM8結(jié)構(gòu),本研究利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)篩選了不同的克隆提高蛋白產(chǎn)量,以及篩選不同去污劑以提高蛋白穩(wěn)定性,最終得到高產(chǎn)量和高純度的人源TRPM8蛋白。同時(shí),我們成功組裝TRPM8蛋白于納米圓盤之中,其抗原可用于免疫獲得治療TRPM8相關(guān)疾病如慢性疼痛、冷疼痛和偏頭痛等的抗體。此外,良好的生化和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明,利用單分子冷凍電鏡技術(shù)我們將在短期獲得人源全長(zhǎng)的TRPM8結(jié)構(gòu)。 

【文章來(lái)源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TRPM8（灰色）與薄荷醇類似物WS-12（綠色）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)圖[40]

第二章TRPM8蛋白的克隆載體構(gòu)建孵育1h，取200uL的菌液涂布于含有氨芐青霉素的瓊脂平板上，放置在37℃的孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜。（4）第二天取出瓊脂平板，觀察菌落的狀態(tài)排除是否有雜菌污染。從中挑選6-8個(gè)大小均勻靠近中心的菌落，用小槍頭小心挑起后打入5mL加了氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，放置在37℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至少10h，直至菌液明顯混濁，放入4℃冰箱中保存。（5）取菌液進(jìn)行上述PCR步驟，跑膠后放置在紫外燈下進(jìn)行觀察。若能得到明顯條帶的則為陽(yáng)性菌，分裝菌液送去測(cè)序，與模板DNA序列進(jìn)行比對(duì)，若無(wú)突變，進(jìn)行菌液小提后保存質(zhì)粒，若有突變則重復(fù)上述步驟直至獲得沒(méi)有基因突變的重組克攏2.4討論分子克隆是把目的基因插入克隆載體之中，在體外形成重組克隆載體，從而獲得大量目的基因的一種方法，它的出現(xiàn)為多種學(xué)科如醫(yī)學(xué)、工業(yè)生產(chǎn)、基因治療等的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，我們成功獲得了三個(gè)TRPM8的重組克隆，測(cè)序均無(wú)突變：全長(zhǎng)TRPM8FL（1-1103AA）、截掉C端的TRPM8CTD（1-993AA）和截去了N、C端即跨膜區(qū)的TRPM8TMD（640-993AA）。它們的N端都連接了一個(gè)麥芽糖結(jié)合蛋白MBP以方便蛋白純化，以及一個(gè)HRV3C位點(diǎn)，這種水解限制位點(diǎn)有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中從蛋白質(zhì)上切除MBP標(biāo)記。這三種克隆載體將應(yīng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)之中。圖2.1TRPM8三種克隆的示意圖。這三種克隆的載體pEGBacMam上均帶有MBP標(biāo)簽（藍(lán)色）和HRV3C位點(diǎn)（紫色）。A.TRPM8全長(zhǎng)（TRPM8FL）B.截掉C端的TRPM8（TRPM8CTD）C.截掉N端和C端即跨膜區(qū)TRPM8（TRPM8TMD）、9

第三章TRPM8蛋白的克隆和純化條件篩選圖3.1三種克隆的TRPM8蛋白的SEC結(jié)果以及SDS-PAGE結(jié)果。A.TRPM8FLB.TRPM8CTDC.TRPM8TMDD.在SDS-PAGE中分析了這三個(gè)克隆的純化蛋白，并用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色。條帶1：TRPM8FL；條帶2：TRPM8CTD；條帶3：TRPM8TMD。3.4.2表達(dá)條件的篩選由于TRPM8TMD蛋白具有最高的產(chǎn)量，因此在大規(guī)模表達(dá)純化蛋白之前，我們選用該克隆來(lái)篩選蛋白質(zhì)表達(dá)的最佳條件。3.4.2.1表達(dá)溫度對(duì)蛋白產(chǎn)量的影響在之前的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)研究中已經(jīng)表明，降低病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的培養(yǎng)溫度可以提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。這是由于在低溫培養(yǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的速率相對(duì)較慢，這使得膜蛋白能夠被正確地折疊并整合到脂質(zhì)膜中[31]。為了驗(yàn)證表達(dá)溫度對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響，我們分別在加入三代病毒后將兩份細(xì)胞轉(zhuǎn)移至30℃和37℃的搖床中分別培養(yǎng)，72小時(shí)候收集對(duì)應(yīng)細(xì)胞并進(jìn)行純化，方法步驟同上。圖3.2（A）表明,在30℃條件下培養(yǎng)的細(xì)胞TRPM8TMD蛋白產(chǎn)量是在37℃條件下培養(yǎng)的10倍，且單分散性更好，這證明降低溫度是提高蛋白產(chǎn)量必不可少的條件。16

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]衛(wèi)95塊沉積相研究[J]. 岳立強(qiáng),張霞,李延濤,汪重慶.  科技視界. 2018(16)



本文編號(hào)：3222798