遺傳代謝病是一種先天的、遺傳代謝功能障礙的一類疾病。多數(shù)是因?yàn)榫S持機(jī)體正常代謝的酶或受體的編碼基因出現(xiàn)了異常而引發(fā)的一系列單基因遺傳病。Reed綜合征,是一種罕見(jiàn)的常染體顯性遺傳病,患者往往患有皮膚平滑肌瘤,而且患者患腎癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常人。FH基因在Reed綜合征中起著重要的作用。本研究在患有Reed綜合征子宮平滑肌瘤的家系中鑒定出新發(fā)的FH突變c.557 G>A（p.S186N）,并且進(jìn)行了一系列研究以確認(rèn)該突變的致病性。對(duì)于該病的研究,我們首先利用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)Reed綜合征先證者血液進(jìn)行了測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了該患者攜帶FH c.557G>A突變,并且該突變點(diǎn)尚未報(bào)道,因此本研究將圍繞FH c.557G>A突變的致病機(jī)制展開研究。利用生物信息學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法對(duì)突變體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析;通過(guò)構(gòu)建pEGFP-FH-WT和pEGFP-FH-MT的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)FH c.557G>A突變體蛋白在細(xì)胞中的定位是否發(fā)生變化;通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FH c.557G>A突變體對(duì)細(xì)胞增殖速度的影響;通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 遺傳代謝病
    1.2 Reed綜合征
        1.2.1 概述
        1.2.2 臨床癥狀
        1.2.3 研究現(xiàn)狀
        1.2.4 富馬酸水合酶(FH)
        1.2.5 FH基因突變
    1.3 先天性去糖基化障礙(NGLY1-CDDG)
        1.3.1 概述
        1.3.2 臨床癥狀
        1.3.3 研究現(xiàn)狀
        1.3.4 N-聚糖酶(NGLY1)
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 Reed綜合征相關(guān)基因FH新突變位點(diǎn)c.G557A的鑒定及致病機(jī)制研究
    2.1 引言
    2.2 研究對(duì)象與材料
        2.2.1 研究對(duì)象
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 儀器設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 血液基因組DNA的提取
        2.3.2 利用Sanger測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證FH突變位點(diǎn)
        2.3.3 FH突變位點(diǎn)的序列保守性及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析
        2.3.4 免疫熒光檢測(cè)突變蛋白在細(xì)胞中的定位
        2.3.5 FH四聚體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)
        2.3.6 FH富馬酸酶活性的測(cè)定
        2.3.7 cck8 檢測(cè)細(xì)胞增殖
        2.3.8 使用Seahorse XF24 通量分析儀測(cè)量穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞外酸化率
        2.3.9 Western Blot
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 患者信息及測(cè)序結(jié)果
A 突變導(dǎo)致酶活性降低">        2.4.2 FH c.557G>A 突變導(dǎo)致酶活性降低
        2.4.3 富馬酸水合酶四聚體的異常及FH突變體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的定位
        2.4.4 FH突變體引起細(xì)胞表型發(fā)生改變
        2.4.5 FH突變體引起mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和自噬失調(diào)
    2.5 討論與分析
第三章 去糖基化疾病相關(guān)基因NGLY1 新突變位點(diǎn)的鑒定和致病機(jī)制研究
    3.1 引言
    3.2 研究對(duì)象與材料
        3.2.1 研究對(duì)象
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 儀器設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 血液基因組DNA的提取
        3.3.2 利用全外顯子和Sanger測(cè)序技術(shù)鑒定NGLY1 突變位點(diǎn)
        3.3.3 免疫熒光檢測(cè)突變蛋白在細(xì)胞中的定位
        3.3.4 NGLY1 野生型與突變體表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.5 敲低NGLY1 的慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
        3.3.6 Western Blot檢測(cè)穩(wěn)定敲低NGLY1 的細(xì)胞株
        3.3.7 NGLY1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.8 免疫共沉淀(IP)
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鑒定及驗(yàn)證">        3.4.1 NGLY1 新突變位點(diǎn)c.1231G>A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鑒定及驗(yàn)證
        3.4.2 NGLY1 基因突變對(duì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的影響
        3.4.3 NGLY1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定敲低細(xì)胞系的篩選及驗(yàn)證
        3.4.4 與NGLY1 相互作用的蛋白的鑒定
    3.5 討論與分析
第四章 斑馬魚Ngly1 的生物學(xué)特性及克隆表達(dá)研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.3 儀器設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 分子克隆和質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.2 斑馬魚的解剖
        4.3.3 RT-PCR和 qRT-PCR
        4.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.3.5 生物信息學(xué)分析
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 生物信息學(xué)分析
        4.4.2 斑馬魚ngly1 的克隆與表達(dá)
        4.4.3 ngly1 的組織特異性表達(dá)
        4.4.4 胚胎發(fā)生過(guò)程中ngly1 的時(shí)空表達(dá)
    4.5 討論與分析
總結(jié)與展望
    1 總結(jié)
    2 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人情況及聯(lián)系方式



本文編號(hào)：3191428