遺傳代謝病是一種先天的、遺傳代謝功能障礙的一類疾病。多數(shù)是因為維持機體正常代謝的酶或受體的編碼基因出現(xiàn)了異常而引發(fā)的一系列單基因遺傳病。Reed綜合征,是一種罕見的常染體顯性遺傳病,患者往往患有皮膚平滑肌瘤,而且患者患腎癌的風險遠遠高于常人。FH基因在Reed綜合征中起著重要的作用。本研究在患有Reed綜合征子宮平滑肌瘤的家系中鑒定出新發(fā)的FH突變c.557 G>A（p.S186N）,并且進行了一系列研究以確認該突變的致病性。對于該病的研究,我們首先利用Sanger測序技術對Reed綜合征先證者血液進行了測序分析,發(fā)現(xiàn)并驗證了該患者攜帶FH c.557G>A突變,并且該突變點尚未報道,因此本研究將圍繞FH c.557G>A突變的致病機制展開研究。利用生物信息學、生物化學和細胞生物學的方法對突變體蛋白的結構和功能進行分析;通過構建pEGFP-FH-WT和pEGFP-FH-MT的真核表達載體,轉染細胞,利用免疫熒光技術檢測FH c.557G>A突變體蛋白在細胞中的定位是否發(fā)生變化;通過細胞增殖實驗檢測FH c.557G>A突變體對細胞增殖速度的影響;通過構建穩(wěn)... 

【文章來源】：山西大學山西省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 遺傳代謝病
    1.2 Reed綜合征
        1.2.1 概述
        1.2.2 臨床癥狀
        1.2.3 研究現(xiàn)狀
        1.2.4 富馬酸水合酶(FH)
        1.2.5 FH基因突變
    1.3 先天性去糖基化障礙(NGLY1-CDDG)
        1.3.1 概述
        1.3.2 臨床癥狀
        1.3.3 研究現(xiàn)狀
        1.3.4 N-聚糖酶(NGLY1)
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 Reed綜合征相關基因FH新突變位點c.G557A的鑒定及致病機制研究
    2.1 引言
    2.2 研究對象與材料
        2.2.1 研究對象
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 儀器設備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 血液基因組DNA的提取
        2.3.2 利用Sanger測序技術驗證FH突變位點
        2.3.3 FH突變位點的序列保守性及三級結構建模分析
        2.3.4 免疫熒光檢測突變蛋白在細胞中的定位
        2.3.5 FH四聚體結構的檢測
        2.3.6 FH富馬酸酶活性的測定
        2.3.7 cck8 檢測細胞增殖
        2.3.8 使用Seahorse XF24 通量分析儀測量穩(wěn)定細胞系的細胞外酸化率
        2.3.9 Western Blot
    2.4 實驗結果
        2.4.1 患者信息及測序結果
A 突變導致酶活性降低">        2.4.2 FH c.557G>A 突變導致酶活性降低
        2.4.3 富馬酸水合酶四聚體的異常及FH突變體在轉染細胞中的定位
        2.4.4 FH突變體引起細胞表型發(fā)生改變
        2.4.5 FH突變體引起mTOR信號轉導和自噬失調
    2.5 討論與分析
第三章 去糖基化疾病相關基因NGLY1 新突變位點的鑒定和致病機制研究
    3.1 引言
    3.2 研究對象與材料
        3.2.1 研究對象
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 儀器設備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 血液基因組DNA的提取
        3.3.2 利用全外顯子和Sanger測序技術鑒定NGLY1 突變位點
        3.3.3 免疫熒光檢測突變蛋白在細胞中的定位
        3.3.4 NGLY1 野生型與突變體表達載體的構建
        3.3.5 敲低NGLY1 的慢病毒載體的構建及穩(wěn)定細胞株的篩選
        3.3.6 Western Blot檢測穩(wěn)定敲低NGLY1 的細胞株
        3.3.7 NGLY1 過表達載體的構建
        3.3.8 免疫共沉淀(IP)
    3.4 實驗結果
A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鑒定及驗證">        3.4.1 NGLY1 新突變位點c.1231G>A(p.R411X)和c.1405G>A(p.R469 X)的鑒定及驗證
        3.4.2 NGLY1 基因突變對蛋白質在細胞內定位的影響
        3.4.3 NGLY1 過表達載體的構建和穩(wěn)定敲低細胞系的篩選及驗證
        3.4.4 與NGLY1 相互作用的蛋白的鑒定
    3.5 討論與分析
第四章 斑馬魚Ngly1 的生物學特性及克隆表達研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與儀器
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 儀器設備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 分子克隆和質粒構建
        4.3.2 斑馬魚的解剖
        4.3.3 RT-PCR和 qRT-PCR
        4.3.4 細胞培養(yǎng)
        4.3.5 生物信息學分析
    4.4 實驗結果
        4.4.1 生物信息學分析
        4.4.2 斑馬魚ngly1 的克隆與表達
        4.4.3 ngly1 的組織特異性表達
        4.4.4 胚胎發(fā)生過程中ngly1 的時空表達
    4.5 討論與分析
總結與展望
    1 總結
    2 展望
參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人情況及聯(lián)系方式



本文編號：3191428