本文關(guān)鍵詞：Aquaporin-9在前列腺癌pc-3細(xì)胞株中表達(dá)及意義（附病例報(bào)告），由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是威脅男性健康的常見疾病之一,尤其對(duì)于年齡超過50歲的男性,其發(fā)病率呈指數(shù)增長(zhǎng)。與歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家相比,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率較低,2002年的年齡標(biāo)化發(fā)病率為1.6/10萬(wàn),遠(yuǎn)低于美國(guó)的124.8/10萬(wàn),但近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng),人口老齡化進(jìn)程加速,以及生活習(xí)慣的不斷西方化,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)快速增加趨勢(shì)。然而迄今為止,前列腺癌的發(fā)病機(jī)制并未完全研究明晰,且前列腺癌發(fā)病隱匿,臨床早期癥狀不典型,同時(shí)基于我國(guó)國(guó)情以前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)為基礎(chǔ)的早期前列腺癌篩查活動(dòng)在全國(guó)推廣較困難,臨床上大約1/3患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)局部浸潤(rùn)或(和)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,從而失去根治機(jī)會(huì),回顧性病例分析顯示前列腺癌發(fā)病中位年齡在72歲左右,考慮患者預(yù)期壽命及身體狀態(tài),臨床多采用以內(nèi)分泌治療為主的綜合治療方案以延緩疾病進(jìn)展和改善患者相關(guān)不適癥狀。自從1940年Huggins和Hodges證明雄激素撤退治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)對(duì)前列腺癌的明確治療效果以來(lái),其一直作為前列腺癌系統(tǒng)治療的主要方案,雖然患者經(jīng)過12-30個(gè)月治療敏感期后最終都將不可逆的發(fā)展為趨勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)但雄激素受體信號(hào)通路始終保持激活狀態(tài),這就提示該信號(hào)通路中及下游相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)是前列腺癌發(fā)生和發(fā)展的重要依據(jù)。我們前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)雄激素可以上調(diào)AQP9在前列腺的表達(dá),且AQP9表達(dá)水平與體內(nèi)雄激素水平之間表現(xiàn)出聯(lián)動(dòng)關(guān)系,進(jìn)而我們推測(cè)前列腺上皮細(xì)胞只有在雄激素作用下維持AQP9的定量表達(dá)及保持細(xì)胞滲透環(huán)境平衡的條件下才能存活。而前列腺癌細(xì)胞是否也表現(xiàn)出相似的生物學(xué)特性以及干擾AQP9基因表達(dá)后是否影響癌細(xì)胞存活,關(guān)于這方面的報(bào)道卻很少,本實(shí)驗(yàn)正是基于此背景下展開的關(guān)于前列腺癌細(xì)胞AQP9表達(dá)定位情況及干擾其在癌細(xì)胞表達(dá)后對(duì)癌細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究,并初探討AQP9表達(dá)通路及其與細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系,從而為前列腺癌在基因水平尋找新的治療方向和靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。目的:(1)體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株pc-3,并檢測(cè)AQP9蛋白在pc-3細(xì)胞株中表達(dá)水平及定位情況,揭示pc-3細(xì)胞株中AQP9蛋白基本特點(diǎn)。(2)化學(xué)合成針對(duì)人AQP9(human,h)的小片段干擾RNA(small interference RNA,si RNA)并干擾pc-3細(xì)胞AQP9基因的表達(dá),分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)基因下調(diào)情況,并研究干擾后的前列腺癌pc-3細(xì)胞株生物學(xué)行為變化如細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡等,進(jìn)而初步探討以AQP9基因作為治療靶點(diǎn)的前列腺癌基因治療的新策略的可行性。材料與方法:(1)體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株pc-3,分別采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)及western blot檢測(cè)AQP9蛋白在pc-3細(xì)胞株中表達(dá)定位情況,并以人正常肝組織中AQP9蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。(2)根據(jù)si RNA設(shè)計(jì)原則由試劑公司(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC)設(shè)計(jì)合成并發(fā)揮高效抑制作用的AQP9 si RNA(h)。培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株pc-3至細(xì)胞融合度達(dá)到60-80%時(shí),采用脂質(zhì)體2000(lipofectamine 2000)介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將AQP9 si RNA(h)轉(zhuǎn)染入前列腺癌細(xì)胞株pc-3中,觀察轉(zhuǎn)染效果,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control)、實(shí)驗(yàn)組(si RNA)、Mock對(duì)照組(lipo2000),通過熒光定量PCR及western blot檢測(cè)AQP9 m RNA及蛋白在pc-3細(xì)胞三個(gè)處理組之間表達(dá)水平的變化。(3)分別采用MTT法及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)三個(gè)處理組pc-3細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:(1)細(xì)胞免疫熒光及western blot顯示兩種前列腺癌細(xì)胞株pc-3及LNCap中均有AQP9蛋白表達(dá),且細(xì)胞免疫熒光顯示AQP9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,western blot顯示AQP9蛋白分子量約26-34KDa,并且在pc-3及LNCap細(xì)胞中相 對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.01,0.57±0.01,人正常肝組織AQP9蛋白相對(duì)表達(dá)量為8.1±0.01,肝組織中表達(dá)量最高,兩種癌細(xì)胞株間pc-3細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)水平較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)AQP9 si RNA(h)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前列腺癌pc-3細(xì)胞株48小時(shí)后,各處理組AQP9 m RNA相對(duì)表達(dá)量分別為:control(6.77±0.39),si RNA(0.12±0.02),lipo2000(6.67±0.30);AQP9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:control(0.109±0.001),si RNA(0.0363±0.02),lipo2000(0.12±0.011),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組前列腺癌pc-3細(xì)胞株在m RNA及蛋白水平AQP9表達(dá)量均較其他兩組下降,單因素方差分析結(jié)果提示si RNA與control及l(fā)ipo2000之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并且在m RNA水平存在顯著性差異(P0.01),而control與lipo2000之間比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。(3)MTT法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前列腺癌pc-3細(xì)胞株48小時(shí)后各處理組癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,結(jié)果顯示以空白對(duì)照組(control)為參照,轉(zhuǎn)染組(si RNA)癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制,抑制率為43.6%,Mock對(duì)照組(lipo2000)抑制率幾乎為0,各組細(xì)胞在450nm處吸光度分別為:control(0.58±0.08),si RNA(0.32±0.03),lipo2000(0.61±0.11),單因素方差分析結(jié)果提示si RNA與control及l(fā)ipo2000之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而control與lipo2000之間比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前列腺癌pc-3細(xì)胞株48小時(shí)后各處理組癌細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組(si RNA)癌細(xì)胞凋亡率明顯增加,凋亡率為4.63%±0.09%,較空白對(duì)照組(control)1.6%±0.15%及Mock對(duì)照組(lipo2000)1.61%±0.05%差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),而空白對(duì)照組和Mock對(duì)照組之間比較無(wú)顯著性差異(p0.05)。結(jié)論:(1)AQP-9在兩種前列腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá),且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),但pc-3細(xì)胞株AQP9表達(dá)水平高于LNCap細(xì)胞株,可能與pc-3細(xì)胞株高代謝活性有關(guān)。(2)RNA干擾(RNAi)技術(shù)可特異性沉默前列腺癌pc-3細(xì)胞株AQP9基因在m RNA及蛋白水平的表達(dá)。靶向沉默pc-3細(xì)胞株AQP9基因表達(dá)后,癌細(xì)胞的增殖活性明顯受抑制并可誘發(fā)凋亡,早期凋亡率明顯增加,進(jìn)而設(shè)想以AQP9為靶點(diǎn)的前列腺癌基因治療的可能性。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 Aquaporin-9 RNA干擾 增殖 凋亡 基因治療
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 第一部分 Aquaporin-9 在前列腺癌pc-3 細(xì)胞株中表達(dá)及意義7-46
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-14
• （一）前言14-16
• （二）資料與方法16-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器16-21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
• （三）結(jié)果31-38
• 3.1 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)及western-blot印跡法檢測(cè)AQP9蛋白pc-3 及LNCap細(xì)胞中的表達(dá)31-33
• 3.2 Real -time PCR及western-blot印跡法檢測(cè)干擾AQP9在pc-3 細(xì)胞AQP9 m RNA及蛋白表達(dá)水平變33-36
• 3.3 MTT法檢測(cè)干擾AQP9表達(dá)后pc-3 細(xì)胞增殖活變化36-37
• 3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾AQP9表達(dá)后pc-3 細(xì)胞凋亡變化37-38
• （四）討論38-42
• 4.1 AQP9在pc-3 及l(fā)ncap細(xì)胞中表達(dá)意義38-39
• 4.2 RNA干擾技術(shù)在前列腺癌研究中的應(yīng)用及沉默AQP9后誘導(dǎo)pc-3 細(xì)胞凋亡機(jī)制39-42
• （五）結(jié)論42-43
• （六）參考文獻(xiàn)43-46
• 綜述46-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 縮寫詞表56-57
• 第二部分 TUPR聯(lián)合內(nèi)分泌治療伴下尿路梗阻的晚期前列腺癌療效分析（附35例報(bào)告）57-72
• 中文摘要57-59
• 英文摘要59-61
• （一）前言61-62
• （二）資料與方法62-64
• （三）結(jié)果64-65
• （四）討論65-69
• （五）結(jié)論69-70
• （六）參考文獻(xiàn)70-72
• 致謝72-73

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄭博;Aquaporin-9在前列腺癌pc-3細(xì)胞株中表達(dá)及意義（附病例報(bào)告）[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：Aquaporin-9在前列腺癌pc-3細(xì)胞株中表達(dá)及意義（附病例報(bào)告），，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：316993