目的:純化原核表達的剛地弓形蟲棒狀體17蛋白（Rhoptry protein17,ROP17）,制備其多克隆抗體,并進行效價和免疫源性鑒定。構(gòu)建二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶-TgROP17真核表達載體（pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17）,轉(zhuǎn)染人胚腎細胞（HEK 293T）中,血清饑餓后對ROP17參與自噬調(diào)控的作用及其機制進行初步研究。方法:第一部分:將重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ROP17轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）,并用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達。通過親和層析法純化重組蛋白（GST-ROP17）,純化蛋白免疫SD大鼠,制備多克隆抗體,并用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）對其進行免疫源性鑒定。第二部分:以弓形蟲速殖子總RNA為模板,構(gòu)建重組載體pIRES/TgDHFR-TS和重組質(zhì)粒pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17。經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定后,將重組載體轉(zhuǎn)染人胚腎細胞（HEK 293T）,RT-PCR和Western blotting檢測基因和蛋白的表達。第三部分:通過免疫組化觀察感染弓形蟲BALB/c小鼠的腦組織中自... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ROP17重組蛋白的誘導(dǎo)表達Fig1-1InducedexpressionofrecombinantROP17protein

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文14圖1-2純化ROP17蛋白的分析M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量1：純化的ROP17蛋白Fig1-2AnalysisofpurifiedROP17proteinM:proteinstandardmolecularweight1:purifiedGST-ROP17protein2.3ELISA檢測多克隆抗體效價純化的ROP17蛋白三次免疫SD大鼠后，腹主動采血法采集血清，ELISA法檢測多克隆抗體的效價，第三次免疫后的多克隆抗體效價＞1：512000，檢測結(jié)果（表1.1及圖1-2.3）所示：表1.1ELISA法檢測抗體效價圖1-3ELISA法檢測抗體效價結(jié)果SD大鼠抗體效價Fig1-3ResultsofantibodytiterdetectedbyELISAAntibodytiterofSDrats抗體效價陰性對照空白對照1：10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:1280001:2560001:512000大鼠0.18760.18622.21082.08791.67101.29340.94550.63500.47190.37480.27260.2638

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文14圖1-2純化ROP17蛋白的分析M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量1：純化的ROP17蛋白Fig1-2AnalysisofpurifiedROP17proteinM:proteinstandardmolecularweight1:purifiedGST-ROP17protein2.3ELISA檢測多克隆抗體效價純化的ROP17蛋白三次免疫SD大鼠后，腹主動采血法采集血清，ELISA法檢測多克隆抗體的效價，第三次免疫后的多克隆抗體效價＞1：512000，檢測結(jié)果（表1.1及圖1-2.3）所示：表1.1ELISA法檢測抗體效價圖1-3ELISA法檢測抗體效價結(jié)果SD大鼠抗體效價Fig1-3ResultsofantibodytiterdetectedbyELISAAntibodytiterofSDrats抗體效價陰性對照空白對照1：10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:1280001:2560001:512000大鼠0.18760.18622.21082.08791.67101.29340.94550.63500.47190.37480.27260.2638


本文編號：3009600