第一部分構(gòu)建穩(wěn)定敲低S1PR3基因的T-ALL細(xì)胞系目的:通過鞘氨醇-1-磷酸鹽受體3（Sphingosine-1-phosphate receptor 3,S1PR3）siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù),構(gòu)建穩(wěn)定敲低S1PR3的多個(gè)T淋巴細(xì)胞白血�。═ cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL）細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞）。方法:通過構(gòu)建S1PR3 siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,包裝與濃縮病毒,分別感染多個(gè)T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞）,利用q-PCR和Western blot檢測(cè)病毒感染細(xì)胞后S1PR3的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建S1PR3 siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;q-PCR和Western blot結(jié)果顯示成功建立穩(wěn)定敲低S1PR3的多個(gè)T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞）。結(jié)論:成功建立穩(wěn)定敲低S1PR3基因的多個(gè)T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞）,為后續(xù)的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。第二部分S1PR3對(duì)T-ALL細(xì)胞功能的影響目的:明確S1PR3對(duì)多... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

敲低S1PR3重組質(zhì)粒的構(gòu)建100100

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文21以SEB-361逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為骨架，設(shè)計(jì)針對(duì)S1PR3基因的序列（圖1.1A）。通過華大基因公司合成目的片段，進(jìn)行基因克�。▓D1.1B），構(gòu)建敲低S1PR3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒。挑取平板中的菌落進(jìn)行PCR，在挑取的20個(gè)菌落中有8個(gè)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在501bp處有一條明亮的單一條帶，產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖1.1C）；隨后將這8個(gè)陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后再次進(jìn)行PCR，結(jié)果與菌落PCR一致，（由于目的片段未經(jīng)PCR，故不需要進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證）以上結(jié)果表明成功構(gòu)建出含有S1PR3siRNA片段的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒。圖1.1敲低S1PR3重組質(zhì)粒的構(gòu)建敲低S1PR3重組質(zhì)粒示意圖；B.SEB361質(zhì)粒酶切后片段；C.質(zhì)粒PCR鑒定Fig.1.1ConstructionoftheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmidTheknockingdownS1PR3ofrecombinedplasmid;B.SEB361afterenzymecleavage;C.TheresultsofPCRidentifiedrecombined.2.2構(gòu)建穩(wěn)定敲低S1PR3表達(dá)的T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt4細(xì)胞）5"LTRBSDU6siRNAH1U6H1U6H13"LTRAC12345678920001000750500100250bp123bpB100007000400010002000100500

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22利用S1PR3基因siRNA病毒及對(duì)照空載逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞），并將敲低S1PR3表達(dá)的Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞分別命名為Jurkatsi、Cutll1si和Molt-4si。經(jīng)Blasticidin藥篩后，利用q-PCR檢測(cè)其S1PR3mRNA和蛋白表達(dá)水平。q-PCR結(jié)果顯示，Jurkatsi細(xì)胞S1PR3mRNA表達(dá)水平降低至對(duì)照細(xì)胞的40.2%（p<0.01）；Cutll1si細(xì)胞S1PR3mRNA表達(dá)水平降低至對(duì)照細(xì)胞的45.1%（p<0.01）；Molt-4si細(xì)胞S1PR3mRNA表達(dá)降低至對(duì)照細(xì)胞的30.4%（p<0.01）（圖2.2A）。利用Westernblot檢測(cè)其S1PR3蛋白表達(dá)水平。Westernblot結(jié)果顯示，Jurkatsi細(xì)胞S1PR3蛋白表達(dá)降低至對(duì)照細(xì)胞的47.6%（p<0.05）；Cutll1si細(xì)胞S1PR3蛋白表達(dá)降低至對(duì)照細(xì)胞的57.1%（p<0.05）；Molt-4si細(xì)胞S1PR3蛋白表達(dá)降低至對(duì)照細(xì)胞的34.0%（p<0.05）（圖2.2B）。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲低S1PR3的T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Cutll1和Molt-4細(xì)胞）。圖1.2穩(wěn)定敲低S1PR3的T-ALL細(xì)胞系鑒定A.q-PCR檢測(cè)T-ALL細(xì)胞S1PR3mRNA表達(dá)；B.WB檢測(cè)T-ALL細(xì)胞S1PR3蛋白表達(dá);Fig.1.2IdentificationofknockingdownS1PR3stableT-ALLcellsA.mRNAexpressionofS1PR3inT-ALLcells;B.proteinexpressionofS1PR3T-ALLcells


本文編號(hào)：2990560